血管内皮祖细胞线粒体功能失调在糖尿病视网膜微血管病变中作用机制的研究

Diabetic neuro-microangiopathy is the basic pathologic manifestation in diabetic retinopathy. Population decrease and dysfunction of endothelial progenitor cells (EPC) are one of the initiating factors for the diabetic retinopathy. Studies showed that mitochondrial metabolism contributes to stem cell fate determination and Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-α (PPARα) plays an important role in regulating metabolism. This proposal is to study the underlying mechanisms by which PPARα protects EPC mitochondrial metabolism and determine EPC fate in the development of diabetic retinopathy. We employ PPARα knockout and STZ-induced type 1 diabetes mice, with treatment of Fenofibrate to activate PPARα in vivo. Primary EPC is isolated and cultured in different conditions to mimic diabetes and treated with fenofibric acid in vitro. Seahorse metabolic analyzers, mitochondrial membrane potential, will be used to evaluate the effects of diabetes and PPARα on EPC mitochondrial metabolism. Furthermore, using gain-of-function and loss-of-function approaches, we will verify the hypothesized molecular mechanisms, that PPARα, which can be activated by fenofibrate, may negatively regulate ATF2 and control the VDAC channel, a metabolic gate of mitochondrial outer membrane, consequently determines EPC fate and protect EPC from apoptosis under diabetic conditions. The PPARα/ATF2/VDAC signaling pathway proposed in this study will provide fundamental scientific insight and novel therapeutic targets in prevention and treatment of diabetic neuro-microangiopathy through regulation of EPC mitochondrial metabolism.

非增殖期糖尿病视网膜病变血管内皮祖细胞（EPC）数目减少，功能受损是糖尿病视网膜微血管病变造成视力下降的重要始动环节。细胞能量代谢决定细胞命运，PPARα是影响线粒体能量代谢的重要分子。本研究关注PPARα通过改善糖尿病病理状态下的EPC线粒体能量代谢失调改变EPC命运，保护糖尿病视网膜微血管病变的发生发展。动物模型使用STZ诱导的PPARα基因敲除糖尿病鼠及糖尿病对照鼠并给予非诺贝特治疗，体外模型使用糖尿病刺激因素处理EPC并给予非诺贝特酸治疗。运用海马系统和线粒体膜电位评价EPC线粒体功能，分子机制研究通过对信号通路的上调和下调的方法，验证PPARα负性调控ATF2通路，调节VDAC门控通道的开放状态，改变线粒体膜电位，增加EPC数目。为通过调节EPC能量代谢预防和治疗糖尿病视网膜微血管病变提供新思路。

糖尿病视网膜病变（DR）是影响劳动力人口是的首位致盲眼病，发病率逐年升高。糖尿病是一种代谢性疾病，代谢功能障碍是糖尿病并发症的主要病理生理基础。DR按照病程分为非增殖期DR（NPDR）及增殖期DR（PDR）两个时期，微血管病变是其主要病理改变。EPC是血管内皮祖细胞，一方面具有修复受损血管的作用，另外一方面具有促进血管新生的作用，这两种功能均与DR病理过程密切相关。但是对于EPC数目，功能及细胞替代治疗方面的研究尚不充分。.本项目在注重EPC数目变化的同时，提出EPC能量代谢的变化可以调控其细胞表型转化，进而调控EPC的数目。与以往不同，从能量代谢的角度解释DR在不同病程阶段EPC数目变化的机制。研究进一步关注PPARα通过改善糖尿病病理状态下的EPC线粒体能量代谢失调改变EPC命运，保护糖尿病视网膜微血管病变及抑制病理性新生血管生成等病理过程。应用PPARα-/-基因敲除小鼠与正常小鼠对比，使用STZ诱导1型糖尿病模型，EPC的数目降低，细胞增殖及迁移功能下降，同时糖代谢和脂代谢的水平均降低，说明EPC处于静止状态，既不自我复制，也不分化为内皮细胞（EC），因而丧失了修复血视网膜屏障（BRB）的功能，进一步应用PPARα的激动剂非诺贝特可以修复DB/DB2型糖尿病小鼠模型视网膜的线粒体功能。以上实验证明了PPARα对于NPDR的保护作用。分子机制研究通过对信号通路的上调和下调的方法，验证PPARα对于能量代谢相关通路的调控影响EPC的静止与自我复制。进一步应用PDR患者外周血与正常患者对比发现EPC的数目增加伴随其线粒体氧化应激水平升高。在应用视网膜新生血管小鼠模型发现视网膜EPC数目和线粒体功能提高，而非诺贝特作为PPARα激动剂可以抑制EPC向EC过度分化引起病理性新生血管形成。其作用机制与WNT信号通路介导的EPC线粒体生成相关。因而通过实验显示非诺贝特具有DR治疗的前景，可以双向调节NPDR的血管内皮损伤及PDR时期的病理性新生血管形成。下一步的实验方向为如何应用非诺贝特局部用药，并以长效释放的方式给药。

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