大豆疫霉CRN效应因子转运能力研究及分子机制探索

RxLR and CRN effectors are two major classes of cytoplasmic effectors in Phytophthora. A critical breakthrough has been made in translocation mechanisms of RxLR effectors, however, translocation of CRN effectors are largely unknown. Here, two typical CRN effectors will be studied. Translocation potential of these effectors will be investigated by analyses of P. sojae transformants expressing the CRN and reporter gene fusion constructs. It will be evaluated whether entry of these effectors into host plant cell require pathogen-encoded machinery by treating different soybean tissues with CRN recombinant proteins produced by E. coli. In vitro and in vivo lipid binding assays will be conducted to test whether translocation of the CRN effectors are mediated by binding phosphoinositides. Processing and modification patterns of CRN effectors in secretion and translocation processes will be analyzed by comparison of molecular weight of effector proteins produced separately from P. sojae, E. coli and plant. Important elements responsible for CRN effector translocation will be obtained by N-terminal mutation analyses. The results will aid the understanding of CRN effector translocation mechanisms and oomycete pathogenesis, and provide scientific basis for development of novel control strategies against oomycete pathogens by blocking cell entry of effector proteins.

疫霉菌胞内效应因子主要包括RxLR和CRN两类，RxLR效应因子的转运机制近年已取得突破性进展，但对CRN效应因子的转运模式和机制还知之甚少。本项目拟选取2个典型的CRN效应因子，将其与报告基因融合后，转化大豆疫霉菌，检测CRN效应因子是否具有向寄主胞内的转运能力；利用原核表达制备CRN重组蛋白，处理大豆不同组织，明确其转运是否需要病原菌的协助；通过体内和体外磷脂结合实验，分析CRN效应因子是否与RxLR效应因子类似，通过与磷脂分子结合介导进入寄主细胞；比较大豆疫霉、植物和原核三个不同表达体系中CRN效应因子蛋白的分子量大小，探索其在分泌和转运过程中的加工和修饰形式；构建CRN效应因子N端不同突变体，确认负责其转运的关键序列元件。通过研究能初步明确卵菌CRN效应因子的转运特征与机制，期望获得的结果能深化对卵菌致病机制的认识，为探索基于阻断病菌效应因子转运的新型卵菌防控策略提供理论支撑。

我们利用大豆和疫霉作为研究材料，研究探讨了大豆疫霉CRN效应子转运能力和抑制寄主免疫的分子机制，旨在为探索基于阻断病菌效应因子转运的新型卵菌防控策略提供理论支撑。经过四年的努力，我们取得了如下重要研究进展：.（1）发现了大豆疫霉CRN效应子PsCRN108 转运进入寄主细胞。PsCRN108的信号肽能够将转化酵素分泌到酵母细胞外，同时能够将Avr1b效应子的C端功能域转运到寄主细胞中。在侵染过程中它定位于吸器，在植物细胞中则定位在细胞核中。上述结果表明PsCRN108效应子在侵染时通过病原菌吸器分泌并转运到寄主细胞核中起作用。.（2）揭示了PsCRN108抑制寄主基因转录和免疫反应的毒性机理。PsCRN108能结合寄主的Heat shock protein（HSP）基因的启动子，抑制植物內源转录因子与启动子的结合和HSP基因的转录，从而干扰HSP蛋白介导的植物免疫反应，该发现为卵菌中首次鉴定到的能靶向寄主DNA的效应子。.（3）阐释了大豆疫霉效应子PsCRN63和PsCRN115协作调控寄主细胞死亡的分子机制。PsCRN63能在植物中引起细胞死亡，但是可被PsCRN115所抑制。研究发现它们通过与过氧化氢酶的互作来干扰细胞内过氧化氢的内稳态，从而调控在植物上引起的细胞死亡，进而克服寄主植物的免疫反应。.（4）揭示了PsCRN63通过胞内二聚化调控植物先天免疫的作用机理。PsCRN63可以作用于MAPK级联反应的下游来抑制活性氧爆发和胼胝质沉积。PsCRN63蛋白的可以形成一个同源二聚体，而二聚体的形成是PsCRN63行使PTI抑制及细胞死亡诱导功能所必需。.（5）发现了PsCRN115和PsCRN161可以调控植物对病原菌和非生物胁迫的抗性。PsCRN115和PsCRN161在烟草中表达不仅可以促进植物的抗病性，而且可以增加对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。数据分析显示它们可以促进HSP和Cytochrome-P450等基因的表达。结果表明效应子可以通过调控抗逆相关基因的表达来提高植物对生物和非生物胁迫的耐受性。.（6）揭示了辣椒疫霉效应子CRN4抑制寄主抗性和引起细胞死亡的机制，发现CRN4在植物细胞核中通过调控细胞死亡相关基因的表达来诱导细胞死亡。. 受本项目资助，我们在《PLOS Pathogens》、《MPMI》等期刊上发表论文10篇。

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