纳豆激酶分子内分子伴侣与成熟肽断裂的分子机理研究

Nattokinase (NK) is a subtilisin produced during natto fermentation. The gene of NK encodes a signal peptide, a propeptide and a mature peptide. The mature peptide with spatial structure is the active form of NK. The propeptide functions as an intramolecular chaperone (IMC) that organizes the folding of the mature peptide. During this process, the cleavage between IMC and mature peptide is an essential step. Classic theory reveals that nucleophilic attack is introduced by the hydroxyl of S221. However, our previous study showed that the cleavage was observed in S221C mutant, and the rate of cleavage in alkaline solution was faster than that in neutral solution and that in acid solution. These results suggest that nucleophilic attack is introduced by the hydroxyl of solution and not the hydroxyl of S221. Therefore, a new mechanism of cleavage is proposed: The cleavage is caused by hydroxyl of solution with the synergistic effect of active center. In this project, kinetic parameters and thermodynamic parameters of cleavage of S221A mutant are to be determined in different pH environment. These results will further to prove the role of hydroxyl in solution. Furthermore, the interaction between active center and IMC is to be studied, which indicates the synergistic effect of active center. This mechanism would modify or complement the classical theory.

纳豆激酶（NK）是纳豆发酵过程中产生的一种枯草杆菌蛋白酶，其全肽包括信号肽、前导肽和成熟肽。具有空间结构的成熟肽是NK的活性形式，它的形成必须有前导肽作为分子内分子伴侣（IMC）的协助。其中，IMC与成熟肽的断裂是关键步骤。经典理论认为断裂由成熟肽活性中心的S221作为亲核催化剂完成。本人前期工作发现断裂在S221C突变体中仍可发生，且在碱性环境比在中性和酸性环境中的速率快，表明[OH-]而非S221是亲核催化剂，因此提出了一个新的断裂机理：环境中的[OH-]在活性中心的协同作用下，作为亲核催化剂完成断裂。本项目将测定不同pH环境中S221A突变体发生断裂的动力学参数，利用计算机模拟、微量量热技术测定不同pH环境中断裂时的热力学参数，并结合结构模型进一步证明[OH-]的作用；结合生物信息学和定点突变研究活性中心与IMC的相互作用，分析它们的协同作用。本项目的成功实施可修改或补充经典理论。

纳豆激酶（NK）是纳豆发酵过程中产生的一种枯草杆菌蛋白酶，其全肽包括信号肽、前导肽和成熟肽。具有空间结构的成熟肽是NK的活性形式，它的形成必须有前导肽作为分子内分子伴侣（IMC）的协助。其中，IMC与成熟肽的断裂是关键步骤。经典理论认为断裂由成熟肽活性中心的S221作为亲核催化剂完成。课题组根据前期工作，提出了一个新的断裂机理：环境中的[OH-]在活性中心的协同作用下，作为亲核催化剂完成断裂。本项目证明了此机理的正确性。课题组首先运用分子生物学技术，成功构建了活性中心突变体NK（S221A、S221C、D32A和H64A），通过体外折叠的方式模拟NK的折叠过程，分别得到了成熟肽的活性形式并将其纯化。S221A和S221C突变体蛋白几乎丧失了酶活性，D32A和H64A突变体蛋白的酶活性大幅下降，却均可成功折叠，初步证明了其IMC与成熟肽的断裂并不符合经典理论，S221并非亲核催化剂；其次，我们设置不同pH环境，分析四个突变体NK在pH梯度环境下的折叠速率，发现随着pH的升高，其折叠速率也随之升高，进一步说明S221并非IMC与成熟肽断裂的亲核催化剂，而[OH-]可能为此过程的亲核催化剂；再次，我们进一步测定不同pH环境下四个突变体NK的折叠速率，从动力学角度进一步证明[OH-]为亲核催化剂的可能性；同时，我们运用生物信息学，构建并优化了IMC与成熟肽相互作用的结构模型，分析IMC与成熟肽的相互作用，发现其断裂之处（Y77）与S221相距较远（＞3.5Å），且与催化中心其他残基D32、H64和N155也无直接相互作用，与断裂残基附近的氨基酸（I73、H75）则可形成氢键，提示活性中心参与了此断裂过程。且分子生物学的结果表明，四个突变体NK的折叠速率均缓于野生型NK，进一步证明课题组提出的IMC与成熟肽断裂的分子机理的客观存在性，即活性中心与IMC形成的相互作用通过协同作用，辅助[OH-]完成IMC与成熟肽的断裂。此机理的论证表明了IMC与成熟肽断裂的分子机理具有多样性，丰富了蛋白质折叠理论。同时，为提高NK的折叠速率、增强NK的活性或抗氧化性，奠定理论基础，具有应用价值和社会效益。

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