甲状腺乳头状癌的免疫原性及其对生物学行为的影响研究

The incidence of papillary thyroid carcinoma(PTC) has been increasing in recent years. Some cases of PTC are associated with Hashimoto’s thyroiditis(HT) and observed with less lymph node metastasis and better prognosis. The underlining mechanism is not clear and worth to be investigated. The previous work of our group showed that there was difference for cytokines and chemokines within tumor tissue between PTC and PTC associated with HT(PTC/HT). In addition, the product of RET/PTC1 gene fusion had immunogenicity and there was difference for the distribution of HLA genotype among general population, PTC and PTC/HT patients. We hypothesize that the immune system can response to the products of molecular changes that cause PTC. The immune response affects the biology and prognosis of PTC and is one of the mechanism of PTC associating with HT. Based on previous results, we is going to investigate the immunogenicity of PTC through transcriptomics, in silico prediction of peptide–MHC binding and mass spectrometry. The relationship of HLA genotype on PTC and PTC/HT will be analyzed to explore the effect of the local immune response on tumor biology. This study will provide experimental foundation for personalized therapy and immunotherapy of PTC.

近年来甲状腺乳头状癌（PTC）的发病率逐渐增高， 临床观察发现部分合并慢性淋巴细胞性甲状腺炎（桥本甲状腺炎， HT）的PTC淋巴结转移率低，预后更好，其机制值得深入探讨。课题组的前期研究发现PTC和合并HT的PTC组织中免疫相关的细胞因子及趋化因子表达存在差异，同时RET/PTC1基因重排产物具有免疫原性， HLA基因型在正常人群、PTC及合并HT的PTC患者中的分布存在差异。课题组认为机体针对PTC的分子改变的产物能产生的特异性免疫应答，其影响PTC生物学行为和预后， 而且可能是PTC合并HT的机制之一。本课题拟在前期研究基础上，利用转录组测序、计算机HLA结合表位预测和高通量质谱技术，研究PTC发生过程中基因突变产物的免疫原性，分析个体HLA基因型差异与PTC和HT发生的关系，探索PTC诱导的区域免疫反应对其生物学行为的影响。研究将为PTC 的个体化治疗和免疫治疗提供实验基础。

本项目研究PTC相关的分子遗传改变及其产物的免疫原性， 分析个体HLA基因型差异与PTC和HT发生的关系， 探索PTC诱导的免疫反应对其生物学行为的影响。研究通过采集临床标本1）利用PCR-SSP技术检测PTC和PTC/HT患者HLA基因型；2）利用NGS技术对PTC和PTC/HT组的肿瘤组织进行转录组测序，比较PTC和PTC/HT肿瘤基因突变和基因融合情况；3）对PTC标本进行数据非依赖采集质谱分析；联合基因测序结果，分析基因和蛋白的差异表达情况；4）通过网络软件进行新抗原或抗原表位预测与筛选；5）根据表位预测结果，制备相应MHC五聚体，流式细胞分析PTC和PTC/HT组患者外周血及中央区淋巴结特异性T细胞的比率；6）通过免疫组库技术，对PTC患者外周血样品（PBMC）、颈部淋巴结组织（LN）和肿瘤组织（T）的TCRβ进行测序分析。 结果发现1）HLA亚型可能与PTC以及合并HT的PTC的发生存在一定的相关性。2）融合基因分析发现出现于PTC组的12个融合基因织可能与PTC发生发展有关，特别是EPS8L2/TALDO1 和DUOXA1/DUOX2； 转录组测序分析发现PTC癌组织与甲状腺组织差异表达基因3740个，在癌组织中上调表达的基因有1464个，下调表达的基因有2276个。3）具有各自HLA I类分子限制性的KSAELSPFL (融合基因KSR1-LGALS9)、RASCQLTVL(融合基因FARSA-SYCE2)、LAHPGFFYF(基因P4HA1)、KTYERLFYM(基因PHLDB3)和LLYSNGYNY (基因IGKV2(D)-28)等抗原表位，可用于PTC的免疫原性相关研究利用；（4）筛选出HLA-A*11:01限制性的ASVTIEDPK表位，在9例HLA-A*11:01亚型且发生RET/PTC1重排的PTC患者中，外周血PBMC中特异性CD8+T细胞占比在0.69%-1.64%之间，体外刺激培养可增加特异性CD8+T细胞占比。（5）免疫组库分析发现，相对于淋巴结，肿瘤组织淋巴细胞的CDR3多样性低而氨基酸水平CDR3克隆HEC高、氨基酸水平CDR3 V-J重排数少、V-J HEC却多，表明相对于颈部淋巴结组织及外周血中，在肿瘤组织中T细胞可能直接激活并参与抗肿瘤免疫，影响肿瘤的生物学行为。

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