基于上海同步辐射光源的跨膜蛋白鲨烯环氧酶结构与功能研究

The 60-kDa squalene epoxidase, predicted to cross the endoplasmic reticulum membrane 2-3 times, is an essential rate-limiting enzyme in sterol biosynthesis for all eukaryotes, including human and fungus. As such, the control of its enzymatic activity is of great medical importance. In fungus, blocking the catalytic reaction of squalene epoxidase results in lack of the essential lipid ergosterol, a mechanism widely employed to develop antimycotic azole drugs such as Terbinafine; In humans, squalene epoxidase has long been investigated as a drug target for hypercholesterolemia. Unlike the 18 downstream steps, the inhibition at this point does not cause accumulation of sterol substrates, which have stable cyclic structures and hence prone to accumulation at toxic levels. Sharing 56% similarities, squalene epoxidase from human and fungus use the same substrates and cofactors for catalysis. However, most inhibitors of the fungal enzyme do not affect the human homolog. Little is known about the structural mechanism behind the aforementioned biochemical characteristics. Here we propose 1) to solve the crystal structure of squalene epoxidase with the support from the microcrystal beamline BL18U at Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF); and 2) to implement, adapt and develop data collection strategies for microcrystals grown in lipid cubic phase at BL18U, SSRF, along with the structural studies. Successful determination of the squalene epoxidase structure will shed lights in understanding the molecular mechanism for its catalysis, revealing the fine differences between the active sites of the two homologs, explaining how hot-spot mutations on squalene epoxidase cause azole resistance, and rational design of small chemicals as potential drugs.

鲨烯环氧酶位于内质网膜，大小约60 kDa，预测跨膜2-3次，是真核生物，包括人类和低等病原真菌固醇合成途径中的必需限速酶，控制其活性具有重要医学意义。抗真菌药物特布萘芬即通过抑制该酶，阻断合成真菌生存所必需的麦角固醇而发挥作用。人源鲨烯环氧酶是降脂药物的重要潜在靶点，已有抑制剂报道。与其后18个反应相比，抑制鲨烯环氧酶催化步骤不导致环化产物在人体的毒性积累。人源与真菌源的鲨烯环氧酶相似性为56%，两者使用相同底物和辅基，但大多数针对真菌同源蛋白的抑制剂不作用于人源酶。造成上述生化特征的结构机制尚不清楚。本项目拟采用结晶学手段，基于上海同步辐射光源微晶线站，在探索和优化脂立方相微晶数据收集策略的同时，解析人源和真菌源鲨烯环氧酶的三维结构，以深入理解二者催化分子机制及异同点、准确了解已有抑制剂的作用模式、揭示突变真菌抗阿唑类药物的机理，为理性改造和设计小分子药物来调控该酶的活性提供精准模型。

近年来跨膜蛋白结构生物学方法有了很大改进，涌现了如冷冻电镜，新型去垢剂和膜模拟材料，新的蛋白表达和纯化工具，新的结晶方法，新型脂类的应用等。但是膜蛋白结构解析仍然存在很大困难。对于绝大部分膜蛋白来说，分子量仍然很难达到冷冻电镜的门槛，因此，结晶学仍然是跨膜蛋白结构研究的主要技术。然而，跨膜蛋白的结晶往往非常困难。在去垢剂中，蛋白被包裹严重，不容易形成晶体堆积；离开脂双层环境后，蛋白变得不稳定导致结晶困难等等。近年来的脂立方相LCP技术因为模拟了双层膜环境而是膜蛋白结晶的重要有效手段。然而LCP技术因为其介质的特殊性，不被大多数人熟悉和采纳，应用还不够广。申请人也经常被问到，上海光源是否能对LCP微晶进行衍射的问题。本项目力图依托上海光源的同步辐射线站，以脂质代谢重要蛋白质作为科学研究载体，获得LCP晶体并在上海光源进行广泛测试，并发展LCP晶体的优化策略，推动该方法的发展。我们选取了磷脂代谢中重要的跨膜蛋白PlsY进行LCP结晶实验，获得了晶体，在上海光源衍射到1.48埃的分辨率，该结果将鼓励更多同行使用上海光源对LCP晶体进行衍射实验。在LCP的方法学发展上，PlsY的硒代蛋白衍射质量较差，我们采用了短链脂策略，一步将分辨率从4.3埃提升到2.0埃，快速地解决了相位问题。在PlsY与其底物酰基磷酸的结晶中，我们发现长链脂中生长的晶体虽然有疑似底物的电子密度，但不能确定是否是底物，需要提高分辨率。同样，采用短链脂进行结晶时，获得了高分辨率的晶体，但电子密度显示底物可能存在降解。因为酰基磷酸极不稳定，我们采用了低温结晶的方法获得了共晶结构。在PlsY与甘油3-磷酸的共结晶工作中，相反，短链脂的晶体虽然衍射高但都没有底物的存在。我们推测该底物结合口袋在膜边界，而膜边界位置附近的结构域柔性可能受膜环境的影响比较大。分析长链和短链脂环境的不同结构发现，果然，短链的结构B-factor更高。我们因此转而使用长链的脂进行结晶，获得了PlsY与甘油3-磷酸的共晶结构。因为许多跨膜蛋白是重要药物靶点，针对这些药物靶点往往需要开发小分子抑制剂或者激动剂进行活性调控，因此，膜蛋白与小分子配体的共结晶是一个常用的技术手段。该项目提出的优化策略将有助于类似研究。此外，我们开发了一个简单的在LCP系统中进行重原子标记的方法，并在上海光源采集数据，解析了测试膜蛋白的相位，丰富了这一技术体系。

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