驱动蛋白Kinesin-13在棉花纤维发育中的功能研究

Cotton fiber is the most important fiber resources and raw material for textile industry. Researches on molecular mechanism of cotton fiber development is not only in favor of revealing the theoretical problems of plant cell elongation and cellulose biogenesis, but also in favor of making the foundation on improving the fiber qualities through genetic engineering. Kinesin is a protein belonging to a class of motor proteins. Kinesins move along microtuble filaments, and are powered by the hydrolysis of ATP. The active movement of kinesins supports its key roles in cell formation and cell elongation. In Arabidopsis plants carrying the knockout AtKinesin-13A showed more branching points in a thichome. Cotton fibers, which also are referred as trichomes, are single cells that elongate from the epidermis of the ovule. Does the Kinesin-13 play a simler role in cotton fiber? In this study, GhKinesin-13 was cloned from cotton fiber.TRV-VIGS and overexpression trangenic technology were further used to investigate the effects of change in expression level on the fiber development,and determinate the biological functions of GhKinesin-13A, providing the theory basis for the cotton fiber development and quality improvement.

棉花是世界上最重要的纤维作物，是纺织工业重要的原料来源。深入研究棉花纤维形成的分子机制将有助于揭示细胞伸长和纤维素合成等重大理论问题，而且可为利用基因工程手段改良棉纤维品质奠定基础。Kinesin家族蛋白是一类马达蛋白，能利用ATP水解所释放的能量驱动自身及所携带的货物分子沿微管运动，在细胞形成、细胞伸长等方面起着至关重要的作用。研究发现，拟南芥AtKinesin-13A突变导致拟南芥叶表皮毛分支增多，而拟南芥表皮毛和棉纤维发生机制相似，那么Kinesin-13在棉纤维中是否有相同的生物学功能？本项目拟从棉纤维中克隆Kinesin-13亚家族基因，利用TRV-VIGS技术和转基因技术，探讨棉花Kinesin-13基因表达水平的改变对棉纤维细胞发育及品质的影响，明确Ghkinesin-13基因在调控棉花纤维发育过程中的生物学功能，为棉花纤维发育和品质改良提供理论依据。

Kinesin家族是一类马达蛋白，它们能利用ATP水解所释放的能量驱动自身携带货物分子沿着微管运动，在细胞形成、细胞伸长等方面起着关键作用。本研究以拟南芥Atkinesin13A基因序列作为探针序列，利用Blast比对从二倍体雷蒙德氏棉的基因组数据库中发现7个具有较高同源关系的基因。根据基因的序列设计引物，利用RT-PCR技术从陆地棉纤维中分离了这些基因。依据7个基因与Atkinesin13A和Atkinesin13B的同源性高低，依次命名为GhKIS13A1、GhKIS13A2、GhKIS13A3、GhKIS13B1、GhKIS13B2、GhKIS13B3和GhKIS13B4。生物信息学分析表明，7个GhKinesin13均含有典型的KISC马达区域、ATP结合位点和微管结合位点，其马达区域属于中央马达。多重序列比对和进化树分析发现这7个基因可分为Kinesin13A和Kinesin13B两个亚类。实时荧光定量PCR结果表明，7个Ghkinesin13亚家族基因在棉花各组织中均有表达，但表达模式各不相同，其中GhKIS13B4在纤维中优势表达，表明其在纤维发育过程中可能发挥着重要作用。将GhKIS13A1基因连接至pET28a原核表达载体上，诱导表达出GhKIS13A1融合蛋白，生化特性分析发现该蛋白具有依赖核苷酸的微管结合活性、基本ATP酶活性和微管激活的ATP酶活性。将GhKIS13A1构建至植物表达载体pGW17上，分别转化野生型拟南芥和kinesin-13a-1突变体，获得3个过表达转基因株系（GhKIS13A1-OVX）和3个互补表达转基因株系（GhKIS13A1-COM）。结果发现GhKIS13A1-OVX株系与野生型相比表皮毛较少，三叉表皮毛的百分比明显低于野生型，而2叉和皱缩分叉表皮毛百分比增高。GhKIS13A1-COM株系的表皮毛数量明显少于kinesin-13a-1突变体，3叉表皮毛的百分比回复至野生型的水平。研究结果表明GhKIS13A1通过调控表皮毛的数量和分叉参与表皮毛的发育。由于拟南芥和棉纤维的发育机制相似，因此推测GhKIS3A1在纤维发育过程中也具有重要的调控作用。另外，将GhKIS13A1的过表达载体和RNAi干扰载体分别转化棉花，已获得棉花转基因植株，表型分析与分子鉴定工作正在进行之中。

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