ATP通过直接结合作用调节心肌L型钙通道功能的新机制研究

L-type calcium channel (LTCC) plays an important role in excitation contraction coupling process, secretion of hormones and neurotransmitters, and the gene transcription. Previous studies showed that the role of ATP in the regulation of LTCC activities is involved in the protein kinase-mediated phosphorylation pathway. Our group has previously demonstrated that ATP directly binds to cardic LTCC (Cav1.2), providing a novel mechanism by which ATP stabilizes LTCC activity. The present study is to investigate the mechanism by which ATP directly binds to Cav1.2 channel. According to our previous results we hypothesize that there are several binding sites of ATP located on the CT1, NT, and I-II loop fragments of Cav1.2 channel. Furthermore, the binding sites of ATP in CT1 fragment might play more crucial roles in regulation of LTCC activities. In this study, we will identify the ATP binding sites on Cav1.2 channel and investigate functions of the binding sites, by using the peptide mass fingerprint analysis, gene mutation technique, cell transfection and electrophysiology methods. In addition, the present study is undertaken to explore the effect of Ca2+, calmodulin and calmodulin-dependent protein kinase II on ATP binding effeciency. The purpose of this study is to define the mechanism of ATP regulating cardiac LTCC. Furthermore, the study will elucidate pathogenesis of cardiovascular diseases and find new targets for development of novel therapeutic drugs.

L型钙通道在兴奋-收缩偶联、激素分泌和基因转录等过程中发挥重要作用。以往观点认为三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）通过蛋白激酶磷酸化作用调节L型钙通道功能，我们最新研究发现ATP可与心肌L型钙通道直接结合，此结合作用可能是ATP对钙通道调节的新机制，本项目将对这一新机制进行深入的研究和探讨。基于前期实验我们提出ATP在钙通道的CT1、NT和I-II loop等部位存在多个结合位点，并且CT1部位的结合位点在介导钙通道功能方面作用更为关键的假说。本项目拟采用蛋白质谱技术、基因突变、细胞转染和电生理学等方法，探寻ATP在钙通道上的结合位点，鉴定不同位点的功能，并对Ca2+、钙调蛋白和钙调蛋白激酶II对ATP与钙通道结合作用的调节模式进行探讨，为最终建立ATP对心肌L型钙通道调节的新机制奠定基础。本课题对阐明心血管系统疾病的发病机制及寻找治疗药物的新靶点提供新思路

本项目拟研究ATP对心肌L型（Cav1.2）钙通道的调节机制以及相关调节因子的作用。我们前期研究结果表明，ATP和钙调蛋白（calmodulin,CaM）均能与心肌Cav1.2通道结合。本项目通过制备融合蛋白和蛋白结合实验，进一步对ATP的结合部位以及ATP和CaM结合作用进行研究，发现在不同钙离子浓度情况下，ATP对CaM与心肌Cav1.2钙通道的影响作用不同。在心肌Cav1.2钙通道上存在CaM的重要结合部位CT1，在相对较高的钙离子浓度情况下，ATP显著抑制CaM与CT1的结合，而在约为100nM生理浓度的钙离子浓度情况下，随着CaM浓度的增加，ATP先促进后抑制CaM与CT1的结合。由此推测，在生理和病理情况下，ATP与心肌钙通道的结合模式可能不同，并且对CaM结合的调节作用也不同，提示，在某些病理情况下，ATP与钙通道的结合及ATP对CaM结合作用的调节可能扮演重要角色。同时，我们研究了CaMKⅡ对CaM与心肌钙通道的结合作用的影响，发现CaMKⅡ能促进CaM与CT1、IQ的结合，而CIP能抑制CaM与CT1、IQ的结合，通过电生理膜片钳全细胞技术，我们也检测了CIP对心肌L型钙通道电流的影响。实验结果提示CaMKⅡ是重要的CaM与钙通道结合的调节因子，而我们推测此过程可能有ATP的参与。为了进一步明确ATP、CaM与钙通道结合作用在相关心血管疾病中的作用，我们初步进行了与长QT综合征相关的CaM突变体与钙通道结合作用的研究，发现在不同钙离子浓度存在情况下，CaMD130G和CaME141G突变体与钙通道的结合显著下降，此实验结果提示，CaM与钙通道结合作用在诱导长QT综合征的发生中可能发挥重要作用，同时推测ATP可能通过调节CaM与钙通道结合也发挥一定作用。我们也制备了离体心脏心肌缺血再灌注损伤模型，检测了CaMKⅡ等蛋白的表达水平，为明确相关心血管疾病的发病机制打下坚实的基础。本项目研究了ATP和CaM与心肌钙通道结合的详细调节作用，明确了生理和病理情况下， ATP与CaM对钙通道的调节模式，同时阐明了调节因子CaMKⅡ对CaM与钙通道结合作用的影响。不仅如此还进行了相关心血管疾病的初步研究，为明确心血管疾病的发病机制和探索相关治疗措施提供了新的理论依据。

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