粳糯谷子waxy基因启动子载体构建及胚乳瞬时表达分析

Foxtail millet is Chinese special crop and main coarse grain crop in Inner Mongolia autonomous region. Currently, the yield of partial millet cultivar is high but their eating quality is poor. taste quality of some brand millet need to be improved. Rational utilization of millet variety resources, especially waxy varieties, will be urged in millet quality breeding. Waxy or non-waxy millet endosperm, which is closely related to the eating quality, is mainly decided by amylose content. Granule-bound starch synthaseⅠ(GBSSⅠ) is the key enzyme of amylose synthesis. Waxy endosperm arises through the disrupted expression or loss of function of the GBSS1(waxy) gene that encodes GBSS1. Heretofore, not reported for expression and regulation of waxy gene promoters. In this project, waxy and non-waxy millet cultivars during different developmental stages after heading will be used to analysis dynamic expression of mRNA by Real-time PCR quantification during endosperm formation. Clone and predict base sequence and function of waxy promoters by specific PCR amplification, amplified fragments inserted and transformed Escherichia coli cells. Promoter -GUS expression vector construction, Agrobacterium transformation and GUS activity transient expression will be used to detect promoter (deletant) function. Analysis GBSSⅠ enzyme activity and content by SDS-PAGE. The results will provide the theoretical and experimental basis for improving spring foxtail millet quality using the promoters and expression vectors.

谷子是我国的特色作物，也是内蒙古自治区的主要杂粮作物。当前，部分育成品种的产量较高，食味品质欠佳，一些品牌小米的口感亟待提高。因此，合理利用品种资源(特别是糯质资源)是谷子品质育种中的迫切要求。谷子胚乳粳、糯性主要由直链淀粉含量高低决定。颗粒结合型淀粉合成酶Ⅰ(GBSSⅠ)是直链淀粉合成的关键酶，由waxy基因编码。Waxy基因不表达或功能缺失，胚乳为糯质，但迄今尚未见谷子waxy基因启动子表达调控的报道。本项目以开花后不同时期的粳糯谷子为材料，采用实时定量PCR(RT-qPCR)技术研究胚乳形成期mRNA的动态表达变化；应用特异PCR扩增、片段连接转化，克隆waxy基因启动子，预测基序及功能；利用启动子-GUS表达载体构建、农杆菌转化、GUS活性瞬时表达检测启动子(缺失体)功能；通过SDS-PAGE分析GBSSⅠ酶活性和含量，为利用启动子和表达载体改良春谷子品质提供理论和实验依据。

Waxy基因控制谷子淀粉合成，对谷子的食味品质影响较大。启动子影响基因的转录。本研究克隆测序waxy启动子基序和功能预测，研究粳、糯谷子在授粉后不同发育时期waxy基因在转录和翻译水平的表达差异；通过构建不同区域的缺失片段表达载体，经与报告基因GUS连接，初步筛选出启动子中对基因表达调控起重要作用的区域，寻找一些顺式作用元件。（1）利用公谷68（糯质）和赤谷4号（非糯）为亲本杂交后获得200株F2:3分离群体，收获后，在室内进行粳糯性鉴定。鉴定结果如下：粳性：中间类型：糯性比例为1:2:1。（2）提取“赤谷4号” 和“公谷68”叶片基因组DNA。以Waxy基因（Seita.4G022400）的启动子序列为模板，设计Waxy基因的特异性引物，用Taq聚合酶进行扩增，产物与T载体连接，用抗性培养基和PCR筛选阳性克隆后，送公司测序，测序结果与数据库中序列进行序列比对，“赤谷4号”结果相似度为98%，最终未能获得“公谷68”的启动子序列。（3）利用生物信息学软件PlantCARE在线分析waxy基因起始密码子上游2000bp启动子序列，除了发现大量的TATA-box和CAAT-box核心元件之外，还含有ABRE、ARE、LTR、和MBS响应非生物胁迫的顺式作用元件。此外，还发现茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif，和分生组织表达相关元件CAT-box。以及1个WRKY转录因子的结合位点，说明该基因可能受WRKY 转录因子的调控。（4）通过构建waxy:GUS 融合表达载体， 以‘赤谷4号’成熟胚作为外植体，经诱导获得胚性愈伤组织，通过GUS农杆菌侵染，培养获得再生植株，进行GUS染色处理对谷子的不同组织和器官，包括叶片、根、茎、幼穗和种子进行 GUS的活性分析，发现能检测到GUS活性的部位只有谷穗，该结果表明waxy基因在谷穗中特异表达。（5）分别取糯性和非糯材料的花前、花后1d、15d、30d的未成熟的种子，以ACTIN作为内参基因，进行RT-qPCR，检测不同灌浆时期waxy基因的表达量。表明糯性和非糯品种灌浆期的waxy基因表达均呈现先升高后降低，表达量均在开花后25d达到峰值，其中糯性品种花前、花后1d waxy基因表达量差异不显著，非糯品种花后1d表达量显著高于花前，且非糯品种waxy表达的时长和表达量均高于糯性品种。

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