多角度研究细胞穿膜肽的穿膜机制

Cell-penetrating peptides (CPPs) are short cationic peptides capable of traversing cell membranes. While we can use CPPs to accomplish membranes intracellular delivery of many kind of biologically macromolecules. Although CPPs are widely used in biomedicine fields such as drug delivery, biological imaging, gene transfection, but their mechanisms of cell entry are still not very clear. In this project, we will apply several technologies to study the mechanism of CPPs traversing membrane including: sum-frequency-generation, second-harmonic-generation, confocal microscopy. Through these studies we can monitor the structure changes of CPPs interacting with lipid bilayer, lipid molecules alignment and orientation responses with CPPs attachment, the kinetics of CPPs traversing mambrane, snapshots of CPPs traversing membrane types. Combining these results, we try to understand how the CPPs traversing mambrane rate and efficiency is related to CPPs molecular structures. We will clarify whether the lipid bilayer patterns and integrity change play important roles to trigger traversing mambrane with direct translocation or endocytotic pathways. Our study results may deepen our understanding mechanisms of CPPs cell entry, which is beneficial to the design and development of new CCPs.

细胞穿膜肽（CPPs）是一类具有穿透细胞膜功能的正电短肽，它们能携带生物大分子进入细胞。虽然CPPs已经被广泛的应用于药物细胞投递、生物影像、基因转染等生物医学领域，然而人们并没有弄清CPPs进入细胞的机制。在本项目中我们将应用多种激光光谱和显微成像技术研究CPPs的穿膜机理。应用和频光谱技术检测CPPs结构变化以及磷脂分子对CPPs的响应；应用二次谐波产生光谱测量CPPs穿膜动力学过程；应用激光共聚焦显微成像技术观察CPPs的穿膜类型、有无内涵体囊泡的形成。通过研究我们能在分子结构、穿膜动力学、穿膜类型等多个角度揭示CPPs的穿膜机制。我们试图了解CPPs穿膜的速度和效率与多肽结构的关系，澄清的脂质双层的形态、完整性、磷脂翻转等特性是否在不同内化通路的触发上起着作用。CPPs进入细胞机制的深入了解有利于新的CPPs的设计和开发。

本项目主要是应用和频光谱在分子结构水平研究分子结构；应用二次谐波产生光谱测量分子的穿膜动力学；应用显微成像技术观察的穿膜形式。结合多种激光光谱和显微成像技术在分子结构、动力学、穿膜效果等多个角度揭示细胞穿膜肽的作用机制，弥补了在生物细胞现象中对磷脂分子研究的不足。主要成果：.1）应用和频光谱技术研究了磷脂分子的翻转动力学受穿膜肽的影响。通过和频光谱研究了在Pep 1作用下磷脂结构变化。结果表明在穿膜肽Pep 1作用下磷脂双分子层内外翻转的速度变快，且在翻转过程中出现内外层磷脂分子密度不对称的情况。这种内外层磷脂分子密度不对称可能是触发细胞的内吞产生溶酶体囊泡的行为的直接原因。.2） 应用二次非线性光谱技术研究了Ca2+离子诱导带负电磷脂细胞膜的融合机制。成功的测量到Ca2+离子诱导PG囊泡的融合动力学过程，应用和频光谱对磷脂分成中各个基团对钙镁金属离子的响应进行了全面研究，对其金属离子诱导的膜融合机制进行了初步揭示。.3）成像实验研究了全L型和D型氨基酸正电肽与细胞的相互作用。研究发现长链聚D-赖氨酸诱导的细胞死亡是通过坏死行为，其会触发了一个保护性的细胞自噬过程，细胞坏死过程伴随着细胞内钙离子增加、质膜完整性受损和细胞核固缩。9个氨基酸的短链聚L-赖氨酸（LL9）和聚D-赖氨酸（9DL）可以进入溶酶体中，而DL9仅在高浓度(下诱导自噬发生，但不能通过坏死杀死细胞，这与PDL的作用形成鲜明的对比，这表明赖氨酸链的长度可以极大地影响多聚赖氨酸与细胞之间的相互作用。.4）全部或部分D型氨基酸替代手性氨基酸替代显著的改变多肽与细胞膜作用的强度、自身结构及界面水合结构。手性氨基酸替代会极大的改变多肽与细胞的作用行为。我们实验结果中由于手性氨基酸替代导致和频光谱水信号的增强或减弱、甚至整体水分子取向翻转都会为生物中的手性问题解释提供新的方向。实验结果也有望为生物医学中生物药物传递分子设计、生物界面机构控制、以及多肽药物设计提供借鉴。

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