CUX1基因在阵发性睡眠性血红蛋白尿症中通过调控自噬促进克隆增殖的分子机制研究

The pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is closely related to second gene mutation besides PIG-A mutation. In previous work, the applicant found that PNH patients have a variety of mutations in addition to PIG-A mutation, among which the CUX1 gene is believed to decrease the autophagy through affecting Beclin1 gene, promote the proliferation of PNH cells, and may play an important role in the pathogenesis of PNH. Based on previous work, we intend to use PNH patients and PNH mice model as the research objects to explore in-depth the CUX1 gene in regulating autophagy-therefore regulating PNH proliferation. Our research contents are as follows: ① Analysing the expression of CUX1 and its correlation with autophagy and PNH disease status; ② Exploring the signalling pathway of CUX1 gene, and the molecular mechanism of autophagy regulation and PNH proliferation by CUX1 gene through gene microarray in CUX1 overexpression clone, and revealing the effect of CUX1 gene expression on the severity of PNH and the clonal proliferation of PNH; ③ Using animal models to detect the biological characteristics of CUX1 gene in regulating autophagy. This research will be helpful to further explore the pathogenesis of PNH, and will lay an experimental base to find a new therapeutic target for PNH.

阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）发病与除PIG-A基因突变之外的二次基因突变密切相关。申请人前期研究通过PNH患者全基因组外显子测序方法，发现部分PNH患者存在CUX1基因的高频突变。CUX1基因突变可能影响Beclin1基因致自噬水平降低，从而促进PNH克隆增殖，在PNH发病中发挥重要作用。但目前其调控自噬的机制尚不明确。本课题拟在前期研究工作基础上，以PNH患者及PNH小鼠模型为研究对象，对CUX1基因通过调控自噬促使PNH克隆获得增殖优势机制进行深入探索：①分析PNH患者及PNH小鼠模型中CUX1在PNH中的表达及其与自噬、PNH疾病状态相关性；②探索CUX1调节细胞自噬的下游信号通路；构建CUX1高表达PNH克隆，通过基因芯片方法探寻其调控自噬的分子机制；③动物模型检测CUX1基因调控自噬的生物学特性。本研究将有助于深入探索PNH发病机制，为该疾病寻找新的治疗靶点奠定实验基础。

阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）发病与除PIG-A基因突变之外的二次基因突变密切相关。申请人前期发现二次基因突变参与PNH克隆异常增殖，筛选出高频、致病突变CUX1和SUZ12基因突变，进一步探索上述基因突变在PNH患者和动物模型发病机制中发挥的作用，同时着眼于PNH异常克隆增殖与自噬的相互作用，为进一步完善PNH发病机制及提高疗效提供新的诊疗思路。本研究我们得到如下结论：① PNH患者存在除PIG-A基因突变之外的高频、致病突变CUX1和SUZ12基因突变，KEGG通路富集结果中肿瘤相关通路是基因占比最高、个数最多的信号通路。② PNH患者CD59-细胞组CUX1 基因表达下降，且其相对表达量与PNH细胞数量及临床指标呈正相关；与自噬相关基因的表达呈正相关。③慢病毒CUX1转染后，细胞增殖活力下降，凋亡水平增加；自噬水平减低，促进PNH异常克隆增殖。④ PNH患者CD59-细胞SUZ12表达水平和H3K27me3甲基化水平高于CD59+细胞和健康对照，与临床指标呈正相关， SUZ12基因可能通过调控H3K27me3参与PNH异常克隆增殖。⑤ PNH细胞模型中SUZ12表达水平和H3K27me3甲基化水平高于野生型THP-1，SUZ12表达水平与H3K27me3甲基化水平呈正比。⑥ 慢病毒敲低THP-1 WT和THP-1 KD细胞株SUZ12后，shRNA敲低组细胞增殖活性降低、凋亡增加、细胞周期阻滞在G0/G1期，且上述作用在THP-1 KD细胞株更明显。THP-1 KD细胞株shrna敲低组转染后4周CD59+细胞比例明显增加，PIG-A蛋白表达较空病毒组和对照组有所恢复。表明SUZ12过表达状态可以通过调控H3K27me3甲基化水平，影响细胞增殖、凋亡和细胞周期，从而促进PNH异常克隆增殖。⑦造血组织Pig-a基因敲除小鼠（CKO小鼠）骨髓细胞中的Pig-a mRNA和蛋白表达水平明显减低，外周血各系血细胞锚蛋白和锚连蛋白表达缺失，贫血，溶血相关指标（LDH、TBIL、IBIL、FHb、血浆C5b-9）明显增高，骨髓造血组织血容量增加，脾脏内含铁血黄素颗粒增多。CKO小鼠存在稳定的锚蛋白缺失及血管内溶血的疾病表型，PNH小鼠模型构建成功。综上，本研究进一步补充了PNH二次发病机制相关理论，为提高PNH疗效提供了新的研究思路。

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