利用Clcn7基因G763R条件性敲入小鼠进行骨硬化症发病机制及IFNγ干预研究

The clinical manifestations are varied and the correlations between genotypes and phenotypes are complicated in osteopetrosis caused by CLCN7 mutations. Till now no effective drugs. In our previous NSFC study (81270964), we found that except for the dysfunction of osteoclasts, the proliferation and differentiation of medullary cells, the signaling pathways of osteoblast-osteoclast coupling and lysosome might play a role in the pathogenesis. In order to clarify the molecular pathogenesis, we established CLCN7 mutation conditional knock-in mice (Clcn7-G763R). We plan to get the heterozygous and homozygous osteopetrosis animal models by breeding Clcn7-G763R with osteoclast specific Cre (Ctsk-Cre) or medullary cell specific Cre (LyzM-Cre). Depending on these animal models, the bone microstructure, bone strength, the coupling of osteoblast and osteoclast, the proliferation, differentiation and function of osteoclast and lysosome are investigated by microCT, bone histomophormetry, biomechanics and molecular biology. Recently, IFNγ improved the function of osteoclasts have been reported. Therefore, our animal models will be treated with IFNγ to clarify whether IFNγ can improve the clinical manifestations and observe adverse reactions. Our study will be helpful to illustrate the mechanism of drug action and lay a foundation for the exploration of treatment.

CLCN7基因突变骨硬化症临床表现多变，基因型和表型关系复杂且无治疗药物。申请人在前一个国家自然科学基金(81270964)资助的研究中发现除破骨细胞功能障碍外，骨髓细胞增殖分化、成骨-破骨偶联及溶酶体可能与疾病有关但机制不明。为探讨确切的分子机制，本课题组成功构建了CLCN7基因致病突变条件性敲入小鼠(Clcn7-G763R)，拟将其与破骨细胞特异性Cre(Ctsk-Cre)和骨髓细胞特异性Cre(LyzM-Cre)配繁，获得机制研究的纯合及杂合骨硬化小鼠模型，运用microCT、骨组织形态计量学、生物力学和分子生物学等方法，从骨微细结构、骨强度、成骨-破骨偶联、破骨细胞增殖分化和功能及溶酶体等方面揭示CLCN7基因突变骨硬化症发病机制。 同时近年发现IFNγ可改善破骨细胞功能，本课题拟给予骨硬化小鼠IFNγ干预，明确其能否改善临床表型并观察不良反应，阐明作用机制，为寻找治疗药物奠定基础

本研究首先将Clcn7-G763R 基因条件性敲入小鼠与骨髓细胞特异表达LyzM-Cre小鼠繁配，成功获得用于CLCN7基因突变骨硬化症机制研究的小鼠模型。通过骨骼微细结构、骨密度等表型分析、破骨细胞增殖分化和功能鉴定、破骨细胞相关基因表达以及Trap5b测定，明确4周龄时纯合突变小鼠出现表型（骨密度增加、体重减轻且股骨长度较野生型缩短），而杂合突变小鼠在8周龄时出现表型。HE染色发现纯合突变小鼠骨髓腔消失，松质骨骨小梁数量显著增多，软骨肥大区增宽；杂合突变小鼠骨小梁较野生型小鼠增多。细胞实验及功能鉴定发现，与野生型相比，杂合突变小鼠破骨细胞数量无显著差异，但破骨细胞面积增大，骨吸收陷窝提示破骨细胞功能降低。但破骨细胞分化和成熟相关基因nfatc1、c-Fos、Ctsk和Acp5均无显著差异，而且血清Trap5b水平在各组间也均无差异。由此明确突变型小鼠破骨细胞功能受限，骨量显著增加且股骨变短，与破骨细胞分化和成熟无关。本团队进一步利用上述突变小鼠模型（Clcn7-G763RKI/KI/LyzM-CreT纯合小鼠和Clcn7-G763RKI/-/LyzM-CreT杂合小鼠），尝试进行单核细胞移植治疗。通过磁珠筛选的方法获得野生型单核细胞，采用腹腔注射回输至Clcn7-G763RKI/KI/LyzM-CreT纯合小鼠和Clcn7-G763RKI/-/LyzM-CreT杂合小鼠体内，观察治疗前后骨骼表型的差异，取得初步进展。.同时本项目进展过程中继续采集CLCN7基因突变导致OPTA2家系，迄今为止已经累计收治37家，形成了包括血清、DNA、影像学资料、羊水和脐带等样本在内的家系库。通过对各个家系临床表型和致病突变的分析，构成了国人骨硬化症的突变谱，指出国人OPTA2的主要临床表现随着病程的延长而趋于稳定，骨折次数下降。E313K突变携带者临床表型较其他突变携带者严重。对临床表现不典型或较轻的患者特别需要注意检测内含子区域的突变。.此外，本研究团队还参与绘制致病基因突变谱并构建靶向基因测序Panel，对遗传性骨病患者的诊断具有重要临床应用价值。

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