基于化学修饰的信使RNA的大面积骨缺损修复的研究

Large size bone defect repairing remains to be an urgent clinical problem. Chemically modified mRNA (cmRNA) has attracted researchers’ attention due to its effectiveness and safety. When combined with scaffold-free tissue engineering approach, cmRNA can effectively control cell proliferation and differentiation within stem cell constructs, therefore demonstrates tremendous potential in bone regeneration. We have previously developed biomimetic mineral coating coated microparticles for growth factors or their genes delivery and successfully achieved sustained release profiles. The feasibility of this approach has been verified using models both in vitro and in vivo. We also discovered that biomimetic mineral coatings can capture cell-secreted proteins in situ and stabilize proteins under extreme conditions. We hypothesize that stem cell constructs incorporating cmRNA loaded microparticles can generate sufficient amount of growth factors guiding bone formation, while circumvents the safety issue associated with conventional gene therapy. Thus, this proposal will employ 3D stem cell construct incorporating cmRNA-loaded microparticles as our model to treat large size bone defects. Meanwhile, we will explore the feasibility of using cmRNA in bone tissue engineering, as well as elucidate the mechanism of cmRNA-loaded microparticle based approach to transfect scaffold-free stem cell constructs.

大面积骨缺损的修复是亟待解决的重大临床难题。化学修饰的信使RNA（cmRNA）由于其有效性和安全性受到研究者重视。将cmRNA和免支架组织工程方法结合，能够安全有效地控制干细胞复合体内的细胞生长与分化，对于大面积骨缺损修复具有重大潜力。前期研究，我们开发了包被仿生矿化涂层的微颗粒，用于装载生长因子或其编码DNA，实现了生长因子的长效释放，并证实该方法在骨修复中的有效性。我们还开创性地发现仿生矿化涂层对于细胞表达的蛋白质原位捕获及稳定化作用。我们推测，通过使用包被仿生矿化涂层的微颗粒输送cmRNA,能使细胞产生大量生长因子调控骨再生过程，并且规避传统基因治疗的安全性问题。本项目将构建含有装载cmRNA微颗粒的干细胞复合体用于大面积骨缺损的修复。以此为基础，探索cmRNA治疗在骨组织工程中的有效性及优越性，阐明以微颗粒作为cmRNA载体的输送方式在免支架高密度干细胞体系中的作用原理。

虽然大面积骨缺损的修复策略繁多，但采用mRNA递送实现骨再生是尚待探索的科学领域。本项目通过构建纳米仿生矿化涂层并以此为载体实现mRNA的可控装载及释放；并以此为功能单位研究其在细胞转染效率的可行性及优越性。接着，本项目构建cmRNA微颗粒/干细胞复合体，实现对于免支架高密度干细胞复合体的转染，并进一步通过编码不同生长因子的cmRNA的表达，考察仿生矿化涂层对于表达蛋白的原位捕获。在此基础上，本项目通过将该技术手段应用于糖尿病创面的愈合研究，并揭示其在与重组蛋白比较中显示的高生物活性。本项目成功构建cmRNA的新型递送体系实现cmRNA的高效装载和表达，通过仿生矿化涂层实现cmRNA的高效持续表达。同时，发现仿生矿化纳米涂层能够高效原位捕获所表达的活性蛋白，如采用编码bFGF的cmRNA时，高达30%的表达的bFGF吸附于仿生矿化涂层表面并且随涂层降解缓慢释放。此外，本项目发现通过该方法表达的蛋白表现类似于内源性蛋白的生物活性，通过与重组bFGF比较，发现其生物活性约为重组bFGF的1000倍以上，充分显示该方法在蛋白活性方面的优势。本项目通过采用大鼠糖尿病创面修复展示采用仿生矿化微粒递送cmRNA进行创面修复的效果：通过仿生矿化微粒在糖尿病创面模型中递送单剂量bFGF cmRNA，发现所表达的bFGF能够快速促进创面愈合及I型胶原蛋白的表达；与采用重组bFGF的组别比较，cmRNA组别的创面修复速度明显加快，且创面修复指数明显优于重组蛋白组。当使用mRNA抑制剂时，发现其创面愈合受到显著抑制，表明该方法实现的优化创面修复，是通过cmRNA高效表达得以实现。综述，本项目通过利用仿生纳米涂层对于生物制剂的高效装载与释放能力，构建不依赖于病毒的cmRNA递送体系，成功实现cmRNA的原位捕获，并充分展现其生物学效应。本项目的完成为组织工程中基因治疗的应用开辟了一条新路，尤其结合RNA治疗的高速发展，为该技术的推广应用，以及与其他技术平台的整合提供了技术路线。

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