利用CRISPR/Cas9基因编辑技术纠正染色体21三体疾病的研究

Down syndrome (DS), also known as trisomy 21, is a genetic disorder caused by the presence of an additional chromosome 21. It is typically associated with physical growth delays, characteristic facial features and mild to moderate intellectual disability. DS is one of the most common chromosome abnormalities in humans. It occurs in about one per 800 babies born each year. At present, there is no cure for DS. Recently, the applicant reported that an entire chromosome, including sex chromosome and autosome, could be eliminated by CRISPR-mediated multiple DNA cleavages on the targeted chromosome. In this application, the applicant proposes to apply this strategy to correct DS in human iPS cells from DS patients and DS mouse models.

唐氏综合症（Down Syndrome, DS），也称为21三体综合症，由于多了一条额外的21号染色体而引起。患者通常都会有特殊面容、生理发育阻滞、智力障碍以及多发畸形免疫力低下等症状。DS是最常见的染色体异常疾病，每800个新生儿就有1例患者，而目前仍没有有效的治疗方法。最近，申请人团队报道了利用CRISPR基因编辑技术针对单条染色体进行多次切割，可以特异性敲除一整条染色体，包括性染色体和常染色体。在本项目中，申请人提出用改技术来治疗DS可能性，包括治疗DS病人来源的诱导胚胎干（iPS）细胞和DS的小鼠模型。

我们首先全面优化了CRISPR基因编辑技术，包括对DNA编辑和RNA编辑技术进行优化；其次，我们验证了优化后的编辑技术对适应症疾病的治疗效果，证明了基于自主开发的编辑工具开发基因疗法的可靠性，为应用基因编辑技术治疗唐氏综合征疾病提供了技术支持。由于唐氏综合征患者多余出来的完整的或部分的21号染色体，通常是正常父本或母本染色体的相同拷贝，通过敲除多余染色体的方案，很大概率会影响到原本正常的21号染色体，因此，我们从敲除整条染色体的研究方案调整为对DS表型发展有重要作用的关键基因DYRK1A的打靶。DYRK1A是剂量敏感型基因，存在明显的剂量效应，在多余21号染色体上的DYRK1A拷贝会抑制下游NFSR/REST关键表达调控基因的表达，最终造成细胞发育异常。而单倍体剂量的DYRK1A又会引起小头症等发育畸形，因此严格控制该基因的剂量，是基因打靶的关键。CRISPR RNA编辑系统因不引起DNA双链断裂，且具有可逆性，在对剂量敏感性基因的治疗中具有独特优势。以Cas13为代表的现有CRISPR RNA编辑系统的尺寸较大，限制了RNA编辑工具的体内递送效率；另一方面，Cas13蛋白存在广泛的旁切活性，阻碍了RNA基因疗法的在体应用。我们通过宏基因组数据挖掘，筛选鉴定到了目前最小尺寸的Cas13蛋白，并通过建立简单灵敏的Cas13突变体筛选平台，获得了高效且无旁切活性的Cas13蛋白，为应用RNA编辑敲低DYRK1A以治疗和改善DS奠定了基础。

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