肽链释放因子与tRNA的协同进化对终止密码子重新分配的影响

遗传密码子的起源和进化是生命科学的一个悬而未决的命题。现代分子生物学技术的迅速发展和数据的不断积累，使遗传密码子重新分配机制假说备受挑战。本项目通过对八肋游仆虫转录组测序，从不同进化地位的纤毛虫中分离无义抑制tRNA和并向同源肽链释放因子基因，利用肽链释放因子基因敲除的酵母菌株和双荧光素酶报告体系，研究无义抑制性tRNA和肽链释放因子识别终止密码子的特异性、优先性、功能位点以及磷酸化对肽链释放因子密码子识别功能的影响；将基因组复制引入遗传密码子和功能基因的进化研究，探讨tRNA和肽链释放因子功能上的协同进化对终止密码子重新分配的影响，为阐明终止密码子重新分配机制、功能基因进化和生物适应性进化的基本规律提供数据支持。

真核生物细胞中第一类肽链释放因子eRF1识别三个终止密码子UAA、UAG和UGA，水解肽酰-tRNA酯键；第二类肽链释放因子eRF3是一类依赖于核糖体和eRF1的GTP酶，协同调控蛋白质翻译过程中终止密码子的识别。此外还参与细胞周期调控、细胞骨架组装以及细胞增殖和迁移过程。无义突变在基因阅读框中产生UAA、UAG和UGA，形成的无义mRNA表达的翻译质控与蛋白质合成终止过程耦连。.本项目开展了以下五个方面研究：1. 利用原生动物纤毛虫识eRF1别终止密码子的特异性这一特点，克隆游仆虫、四膜虫、赭纤虫、贾第虫、滴虫的肽链释放因子基因作为研究对象，构建了eRF1的结构域嵌合体和关键氨基酸位点突变体，用双荧光素酶报告体系和质粒洗牌技术研究了这些嵌合体和突变体eRF1识别终止密码子的性质和活性。证实了eRF1识别终止密码子的关键结构域和氨基酸位点。尤其是第70位的丝氨酸和126位的亮氨酸位点的改变，对eRF1识别终止密码子第二位和第三位碱基的性质具有决定性作用。证实cavity模型的三个pocket结构中氨基酸对于eRF1识别活性具有重要影响，主要表现在对eRF1识别终止密码子的结构的影响。2. 克隆了纤毛虫阻抑性tRNA，表明纤毛虫细胞中其与eRF1竞争性识别终止密码子，而阻抑性tRNA的反密码子与终止密码子的亲和性高于eRF1，在竞争中占据优势，决定了纤毛虫细胞中终止密码子的重新分配和eRF1的功能的进化。3. eRF1的N端结构域嵌合体研究证实，GTX、NIKS和Y-C-F模体在eRF1识别终止密码子过程中担负重要的功能，决定eRF1的性质。4. eRF1的磷酸化修饰对于其识别终止密码子的特异性和活性具有重要的影响。C端结构域的一些关键的氨基酸对eRF1的识别活性具有一定的影响。5. eRF3通过调控与细胞增殖相关的蛋白质的表达和活性，参与细胞的增殖和周期调控过程,而MicroRNA144通过调控eRF3的表达参与调控细胞的增殖和迁移过程。6. 研究了F9基因和MEN1基因无义突变导致的遗传疾病和肿瘤的分子机制。证实基因的无义突变能够特异性介导mRNA的选择性剪接。基因通读药物可以促进无义mRNA全长翻译，NMD途径抑制药物提高mRNA的积累，两种药物的联合使用可以显著提高细胞中目的蛋白质的含量，对于基因无义突变导致的遗传性疾病和肿瘤的预防和治疗具有重要的应用价值。

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