宇佐美曲霉木聚糖酶耐热/耐碱性的分子改造

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项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31101229
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    22.0万
  • 负责人：
    吴静
  • 依托单位：
    江南大学
  • 学科分类：
    C2002.食品生物化学
  • 结题年份：
    2014
  • 批准年份：
    2011
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2012-01-01 至2014-12-31

项目摘要

木聚糖酶的应用领域与其工业应用特性(如耐热、耐强酸或强碱等)密切相关。本项目通过克隆具有自主知识产权的宇佐美曲霉中编码木聚糖酶的全部基因，与源于其他微生物的具有耐热/碱的木聚糖酶基因进行比对，获得影响热/碱稳定性的优势基因并进行整合构建杂合木聚糖酶；同时采用计算生物学方法确定与热/碱稳定性关联的氨基酸(或氨基酸二联体)及其位点，进行定点突变，以获得热/碱稳定性显著提高的突变酶。预期研究结果进一步丰富对真菌木聚糖酶的结构与功能关系的认识，为制备具有工业应用价值的耐热/耐碱性木聚糖酶提供新的技术途径。

结项摘要

项目克隆了宇佐美曲霉 (Aspergillus usamii) 10和11家族木聚糖酶(AusXyn10A和 AusXyn11D)基因，并在毕赤酵母 (Pichia pastoris) GS115中成功表达，并在此基础上利用计算机辅助设计通过N/C端片段替换、二硫键添加以及点突变对该酶的热稳定性和pH适应性进行了理性/半理性改造研究，主要研究结果如下： (1)构建了一种蛋白天然N端表达质粒pPIC9KM，并应用该质粒将AusXyn10A成熟肽的编码基因整合到P. pastoris GS115基因组中，获得的高拷贝重组子产酶活性高达100.8 UmL-1； (2)将嗜热木聚糖酶TmxB中片段替换AusXyn10A C端的A300NA302，构建并表达重组酶reAusXynCRC1，重组酶在50℃下的半衰期较原酶的有明显的降低；在AusXynCRC1的基础上引入突变H13L和A12K，获得突变酶AusXynCRC2，该突变酶的比酶活较原酶提高38 %，在50℃下保温10 min后残余相对酶活提高到40 %。(3)将嗜热木聚糖酶TaXyn10 N端区域的氨基酸片段替换AusXyn10A相对应的片段，构建并表达N端片段替换酶AusXynCRN1，替换酶的最适温度与原酶reAusXyn10A一致，在55℃下半衰期由6.9 min提高到了8.0 min；在AusXynCRN1中同时引入突变S286G和H288F，获得的替换突变酶reAusXynCRN2的比酶活为8,129 Umg-1，较原酶reAusXyn10A提高49%，最适温度为60℃，较原酶提高了10℃，在55℃的半衰期由6.9 min提高到了72 min，是原酶的10.4倍； (4)分子动力学模拟预测结果，筛选出RMSD值低于原酶AusXyn10A的二硫键突变酶D7C/G42C和S246C/A297C并分别在P. pastoris中表达；突变酶的最适温度较原酶提高了5℃，在50℃保温60 min残余酶活较原酶有明显提高，表明246-297位二硫键的添加能够大幅提高酶的热稳定性； (5)以AuXyn11A 拇指结构基因替换碱性木聚糖酶EvXyn11TS拇指结构基因，获得杂合酶基因 Evxyn11A。杂合酶的最适 pH 为 5.5，较原碱性木聚糖酶 EvXyn11TS的最适 pH 降低 1.0.

项目成果

期刊论文数量（0）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（6）

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
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AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
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          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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