陈元膏摩法经PI3K/AKT信号通路调控兔阳虚寒凝型膝痹软骨降解的作用机制

Knee paralysis is high-risk refractory in the elder,which impact on daily life and work seriously,western medicine for knee osteoarthritis. This topic of chenyuan ointment rubbing use the pale of the "qian jin yi fang”,via the experience of clinical add or subtract, add Su Renjiang cutting,preparation and use of modern technology.So far, At present the study found that the knee paralysis development involving multiple complex regulation of signaling pathwanys. sprevious research found that chenyuan ointment rubbing of treatments for yang deficiency type haemorrheological nature knee paralysis is remarkable,but if via PI3K/AKT pathway regulateng the yang haemorrheological nature and mechanism of action is still unclear.New Zealand rabbits as the research object in this study,based on characteristics of high incidence syndrome in Xinjiang area,this topic proposed a plaster cast method and cold water immersion method for the yang haemorrheological nature,via chenyuan ointment rubbing intervention,using Ellisa,HE and WB monitoring method,approach chenyuan ointment rubbing from PI3K/AKT signaling pathways regulating the yang haemorrheological nature knee cartilage degradation mechani-sm of action,and then provide basis experimental for chenyuan ointment rubbing treat knee paralysis.

膝痹（膝骨性关节炎）是中老年高发难治性疾病，严重影响患者的日常生活和工作。本课题之陈元膏源自《千金翼方》苍梧道士陈元膏的记载，经临床化裁加减、添加维药苏仁江，使用现代工艺制备而成。“膏摩法”是将外用中药膏与推拿手法相结合的中医外治疗法，前期临床发现陈元膏摩法治疗阳虚寒凝型膝痹效果显著。现代研究表明膝痹的发生发展是涉及多条信号通路的复杂调控，但是其作用机制尚不清楚。本研究拟以新西兰大白兔为研究对象，以PI3K/AKT信号通路为调控目标，立足新疆地区阳虚寒凝证型高发的特点，以石膏固定+激素+冷泳法制作兔阳虚寒凝型膝痹模型，经陈元膏摩法干预后，以免疫组化法、HE及WB法为研究方法，观察陈元膏摩法影响膝痹发展的关键因子，探索陈元膏摩法经PI3K/AKT信号通路调控兔阳虚寒凝型膝痹软骨降解的作用机制，进而为临床使用陈元膏摩法治疗膝痹病提供实验依据。

膝痹是中老年高发难治性疾病，严重影响患者的日常生活和工作。本课题之陈元膏源自《千金翼方》苍梧道士陈元膏的记载，经临床化裁加减、添加维药苏仁江，使用现代工艺制备而成。本课题前期工作中流行病学调查结果显示，新疆人群膝痹的患病率较高且以阳虚寒凝型膝痹为高发证型；临床研究证实陈元膏摩法能够修复关节软骨，恢复或重建力学平衡，使筋柔骨正，从而有效治疗膝痹并已发表相关论文多篇；前期实验研究发现陈元膏摩法可以调节膝痹中炎性因子表达，有效减轻关节软骨的破坏。因此，本研究基于前期研究成果，以新西兰大白兔为研究对象，采用高分子绷带屈曲位固定法+薄荷油、气候箱法建立兔阳虚寒凝型膝痹模型，通过HE、WB、免疫组化法及qRT-PCR等技术围绕PI3K/AKT信号通路深入靶向研究陈元膏摩法干预兔阳虚寒凝型膝痹的主要作用靶点。结果显示：（1）陈元膏摩法可使膝关节周围温度升高，加快血液循环，促进组织代谢，一定程度改善阳虚寒凝型膝痹病理组织形态学，缓解并放松膝关节周围痉挛紧张的肌群，有效改善膝关节屈伸功能，恢复纤维组织弹性。（2）陈元膏摩法可增加PI3K活性，增强AKT活化程度，增强下游靶蛋白Bcl-2活化，下调促凋亡蛋白Bax，使软骨组织中Bcl-2，Bax的表达量处于动态平衡，进而抑制骨关节炎病变过程中软骨细胞过度凋亡,促进细胞存活以达到防治阳虚寒凝型膝痹的效果。（3）陈元膏摩法可能通过下调血清中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达、上调抗炎因子IL-10水平，抑制炎性反应、改善关节内炎症微环境从而抑制软骨基质降解及关节软骨破坏。（4）陈元膏摩法可下调兔软骨组织中基质金属降解酶MMP-3、MMP-13mRNA的表达量，上调内源性特异性抑制剂TIMP-1mRNA，使细胞外基质代谢转化维持正常状态，从而减少对软骨基质的破坏，减缓阳虚寒凝型膝痹的进程。综合本项目的研究结果，我们认为陈元膏摩法通过激活PI3K/AKT信号通路抑制软骨细胞过度凋亡、促进细胞存活、调控炎症因子水平、改善软骨基质降解、从而缓解软骨病理损伤，达到防治阳虚寒凝型膝痹的目的。

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