玻璃化冷冻牛卵母细胞发育能力下降与线粒体损伤的关联机制

线粒体是卵母细胞中重要和独特的细胞器，参与了ATP合成、Ca2+动态平衡和细胞凋亡等重要细胞活动。然而，线粒体对低温十分敏感，其冷冻损伤是造成冷冻卵母细胞发育能力下降的重要原因，但目前国内外还缺乏深入研究。为此，本研究采用荧光染色、激光共聚焦显微镜等，分析冷冻前后牛卵母细胞线粒体在空间分布、膜电位方面的差异；采用光漂白后荧光恢复技术，观察冷冻前后高能和低能线粒体的运动规律及变化；采用ATP含量测定、ATP合成酶活性测定、RT-PCR技术，检测冷冻前后卵母细胞中ATP含量、ATP合成酶活性、ATPase6亚基及8亚基基因mRNA表达量的差异；卵母细胞采用Cs A预处理、AFP预处理后进行玻璃化冷冻，采用前述方法分析两者对卵母细胞线粒体的保护作用，并采用孤雌激活和体外受精检测其对冷冻卵母细胞发育潜力的影响等。上述研究，对于阐明卵母细胞冷冻线粒体损伤机理、提高卵母细胞冷冻效率有着重要作用和意义。

线粒体对低温十分敏感，其冷冻损伤是造成冷冻卵母细胞发育能力下降的重要原因，但目前国内外还缺乏深入研究。本课题研究结果表明：（1）玻璃化冷冻会显著性低卵母细胞中线粒体正常分布比例（60.95% vs. 86.51%）。经过FARP之后，与新鲜组相比，玻璃化冷冻组线粒体运动明显加快；（2）玻璃化冷冻能够显著性降低卵母细胞中高能膜电位线粒体与低能膜电位线粒体的比值（新鲜组，1.5；冷冻组，0.9）和ATP含量（新鲜组，815.9 fmol；冷冻组，578.4 fmol）、提高活性氧（ROS）水平（新鲜组，2.8 cps；冷冻组，8.7 cps），这些因素导致冷冻卵母细胞孤雌激活囊胚率和囊胚ATP含量显著性低于新鲜组（新鲜组，43.4%, 759.1 fmol; 冷冻组，23.5%, 536.4 fmol）；（3）卵母细胞玻璃化冷冻前采用40 μg/mL Cs A处理10min，能显著性提高玻璃化冷冻卵母细胞中高能与低能膜电位线粒体的比值（CsA组，1.4）和ATP含量（CsA组，764.7 fmol）、降低ROS水平（CsA组，3.6cps）。Cs A处理冷冻卵母细胞体外受精后的囊胚率要显著性高于冷冻卵母细胞（25% vs. 13%）；（4）体外培养0h、4h、8h过程中，新鲜与冷冻卵母细胞ATP含量的差距（205.5±15.7 fmol, 176.1±11.8 fmol, 146.9±16.1fmol）、ATP合成酶活性的差距（8.9 nmol NADH/min/mg，5.8 nmol NADH/min/mg，4.8 nmol NADH/min/mg）、ROS水平的差距（5.3 ± 0.2 cps, 4.9 ± 0.2 cps, 4.2 ± 0.3 cps）显著性降低。说明冷冻卵母细胞中线粒体功能和抗氧化系统随着时间的延长有一定的恢复；（5）在预处理液10%ED、玻璃化冷冻液EDFS30中各添加500ng/ml 的AFP，并不能够显著性保护线粒体的功能和分布。另外，在本课题的部分资助下课题组研究了玻璃化冷冻对牛囊胚、小鼠卵母细胞及囊胚中重要基因的甲基化水平及其mRNA表达水平。.这些成果分别发表在《Fertil & Steril》（3篇）、《Mol.Reprod.Dev》（2篇）上，对于提高冷冻卵母细胞质量、进而提高其体外发育效率，都有重要的理论意义和实用价值。

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