野苋菜花粉变应原基因筛选、克隆表达及特性分析

高质量变应原是变态反应性疾病临床诊断及治疗的重要保证。国内外研究证实，重组花粉变应原优于粗浸液，能大大提高免疫诊断的特异性和脱敏治疗的疗效，是当今乃至未来变态反应学的重要研究方向。野苋菜花粉作为我国最为重要的变应原之一，目前临床使用的仍为粗浸液变应原。对该粗浸液进行分离、鉴定及纯化，我们发现其蛋白成份较复杂；免疫印迹显示100kD 、70kD、67kD、34kD、17kD等为其主要阳性蛋白带；对野苋菜花粉profilin基因进行克隆表达，显示泛变应原为14kD。强烈提示野苋菜花粉具多种变应原蛋白及相对应的变应原基因。为此，本项目拟在前期工作基础上，构建野苋菜花粉cDNA表达文库，应用特异性IgE进行免疫学筛库，筛选出多个变应原基因，克隆表达并进行特性分析、动物实验及抗原提呈分析，以获取野苋菜花粉的主要及次要重组变应原，为野苋菜花粉重组变应原疫苗的制备、标准化及临床应用提供理论及实验依据。

一、对野苋菜花粉变应原进行了提取、分析、鉴定与纯化.1. 对存放干燥野苋菜花粉进行了变应原提取、分析、鉴定与纯化. 发现提取液中可与阳性病人血清反应的主要蛋白条带的相对分子量为75 kDa，67 kDa，15KD。.2. 对新鲜野苋菜花蕊进行了变应原提取、分析、鉴定与纯化. 在野苋菜花蕊提取液，与过敏性患者血清IgE结合反应阳性的蛋白质分子量分别为67、36、30和15 kDa，为主要变应原。.3.新鲜野苋菜花蕊与存放干燥野苋菜花粉比较. 我们发现，干燥存放后的野苋菜花粉少了36 kDa、30 kDa两条主要变应原蛋白。所以，用新鲜野苋菜花蕊进行野苋菜花粉过敏原基因的克隆表达、纯化，应会更好的实验效果。.二、对野苋菜花粉过敏原基因的克隆表达、纯化. 成功克隆了1个野苋菜花粉泛变应原全长基因。根据变应原的命名规则，将它命名为Ama v 2.01。其由683个碱基组成，开放阅读框为416个碱基（包括终止密码子）。核酸序列及推导的氨基酸序列（133个氨基酸）。经分析这个序列编码的蛋白为小分子量酸性蛋白，等电点为5.26，分子量约为14.4862kD。. 成功构建重组表达质粒（命名为pET28a- Ama v 2.01），有六组氨酸标签，并进行诱导表达，获得重组的蛋白，显示为15KD左右。采用Ni+柱亲和层析的方法纯化重组蛋白，可见200mM咪唑洗脱的峰中含有大量高纯度的目的蛋白。.三、对野苋菜花粉过敏原纯化重组蛋白进行了特性分析.3.1 过敏原纯化重组蛋白的免疫反应性分析. 用对野苋菜花粉过敏的患者血清对纯化的重组野苋菜花粉rAma v 2.01的免疫学活性进行检测，显示能与特异的IgE发生反应，具免疫学活性并较高的特异性。.3.2过敏原纯化重组蛋白的免疫原性分析. 重组野苋菜花粉变应原有较好的免疫原性（数据尚在整理中）.四、重组变应原的免疫及免疫治疗的效果. 应用重组重组野苋菜花粉变应原过敏性鼻炎小鼠进行免疫治疗，初步发现其治疗效果明显优于野苋菜花粉变应原粗提液。具体实验仍在进行。.五、野苋菜花粉变应原蛋白分析. 本拟进质谱分析，但2D电泳图可见上述分子量附近蛋白点太多。现已收集更多的阳性血清，正进行2D 免疫印迹实验，以便更准确的确定目标蛋白。

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