小分子化合物诱导山羊多能干细胞（CiPSC）的研究

Aiming at resolving current issues as exogenous gene integration with host DNA and not fully pluripotent competency on goat iPSC, in this study, we will attempt to screening small molecule chemical compounds, which could replace exogenous transcription factor to reprogram goat somatic cells, to generating naive chemically induced pluripotent stem cell (Naive CiPSC). Meantime, by using the methods of RNA-sqe and iTRAQ+LC-MS/MS, investigating the gene expressing regulate/control network, and establishing optimal technique platform for goat CiPSC reprogramming will be conducted. Consequently, the technique foundation for accelerating goat genetic improvement and efficient CiPSC research platform for other livestock could be established.

针对目前获得的山羊多能干细胞（iPSC）存在外源基因整合到细胞基因组以及不具有完全多能性（Naïve 特性）等问题，本研究拟通过筛选代替外源转录因子重编程山羊体细胞的小分子化合物，获得具有完全多能性化学诱导的多能干细胞（Naive CiPSC）。同时，利用RNA-sqe和蛋白质质谱技术，探讨山羊CiPSC重编程的基因表达调控网络以及相关信号通路，建立完善山羊化学诱导多能干细胞的技术体系。通过上述研究，有望为加速山羊的遗传改良以及其他大家畜CiPSC的研究奠定基础和提供有效的研究平台。

目前获得的山羊多能干细胞（iPSC）存在外源基因整合到细胞基因组以及不具有完全多能性（Naïve 特性）等问题，因此本研究拟通过筛选代替外源转录因子重编程山羊体细胞的小分子化合物，尝试获得具有多能性化学诱导的山羊多能干细胞。本研究通过使用完全小分子化合物诱导培养基重编程山羊耳缘成纤维细胞，获得山羊类诱导多能干细胞（CiPSCs-like）。类克隆显示圆形或者岛屿状三维立体结构，克隆边界清晰，边缘折光性强。另外， RT-PCR结果显示类克隆表达多能相关基因OCT4、SOX2、NANOG、CDH1、TDGF和DAX1；免疫荧光结果显示CiPSCs-like克隆表达多能基因OCT4、SOX2 以及黏连蛋白E-CADHERIN，表面特异性抗原SSEA-1。体外分化实验结果显示CiPSCs-like克隆可以自发分化形成拟胚体及三胚层细胞，RT-PCR结果显示拟胚体表达三个胚层的标志基因。免疫荧光结果显示CiPSCs-like克隆自发分化后形成不同胚层来源的细胞。通过嵌合体实验，获得表达GFP的嵌合体囊胚。另外，在研究中发现不同细胞株对诱导培养基存在明显差异，因此对此现象进行了一些探讨。结果显示山羊细胞株诱导获得的CiPSCs-like克隆和未出现CiPSCs-like克隆的实验组mRNA水平均表达OCT4,SOX2, CDH1及DAX1。而前者糖酵解相关基因PGAM1, KPYM2及HXK2 的mRNA水平显著高于对照组成纤维细胞的表达, 后者mRNA表达水平与对照组无明显差异。在与表观遗传相关的基因中，获得的CiPSCs-like克隆或未出现CiPSCs-like克隆的实验组HAT和SMYD3 的mRNA表达水平和对照组无明显差异，而KDM5B 在未出现CiPSCs-like克隆的实验组显著高于对照组。在此诱导基础上进行诱导体系优化，发现5i培养基诱导获得的克隆是类似于人和猪iPSC克隆的形态。对此了类克隆进行转录组以及蛋白质组学测序分析，结果显示在诱导过程中相关基因的表达变化呈现极强的规律，其中的几个中心基因在调控山羊成纤维细胞的重编中起着关键的作用。目前的这些研究成果为后续重编程机理的进一步研究以及山羊多能干细胞的应用奠定了基础。同时也充实了体细胞重编程，尤其是小分子化合物重编程的理论依据，在重编程研究领域具有很高的借鉴和参考意义。

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