弓形虫氨基肽酶的功能解析及其作为药物靶点的可行性研究

弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种人兽共患寄生虫病, 呈全球性分布。有学者估计，世界上有三分之一的人群感染弓形虫。该病是造成器官移植，艾滋病死亡的一个重要并发病，更重要的是它也是影响人类先天畸形、缺陷、智力低下、死胎、早产的重要病原体之一。目前应用于弓形虫病的药物种类很少，并且并不能彻底清除慢性感染。因此迫切需要加快对新药的研究开发。氨基肽酶作为一种蛋白酶在蛋白质成熟、多肽降解和蛋白质稳定性等方面有关键性作用。很多肿瘤细胞或者病原微生物编码的氨基肽酶已经被鉴定为药物靶点。目前，弓形虫氨基肽酶的研究都是空白。本研究将鉴定弓形虫氨基肽酶基因，通过体外重组表达分析其生化活性；通过基因敲除技术评价氨基肽酶作为弓形虫药物靶点的可能性和解析其在虫体细胞生长发育过程中的功能。

本项目旨在鉴定弓形虫基因组编码的氨基肽酶编码基因，并评价其作为药物靶点的可行性。通过项目三年的运行，基本完成了项目的任务内容，取得了如下研究成果：1. 在弓形虫基因组数据中鉴定了11个氨基肽酶编码基因序列，利用原核表达系统表达了7个氨基肽酶基因，并成功制备了多克隆抗体，利用特异性多克隆抗体的Western blotting表明这7个内源性氨基肽酶在速殖子阶段均有表达；2. 本项目在国内率先构建了弓形虫CRISPR/Cas9新型基因敲除技术，基本与国际同行发表相关成果处于同一时期；3. 利用CRISPR/Cas9技术成功敲除了4个氨基肽酶基因，发现缺失亮氨酸氨基肽酶、天冬氨酸氨基肽酶、氨基肽酶P和一个甲硫氨酸氨基肽酶的弓形虫虫株的生长复制的能力均受到不同程度的影响。另外，缺失亮氨酸氨基肽酶的虫株对宿主细胞的粘附/入侵能力显著下降，对小鼠的毒力也有明显的减弱；4. 利用基因缺失虫株成功分析了亮氨酸氨基肽酶、天冬氨酸氨基肽酶、氨基肽酶P和一个甲硫氨酸氨基肽酶的底物特异性。研究发现，缺失亮氨酸氨基肽酶的虫株对多种氨基肽酶底物降解能力显著下降。缺失天冬氨酸氨基肽酶的虫株也有相似的现象，但同时对亮氨酸氨基肽酶底物的降解能力确显著的增强了。该结果似乎预示着亮氨酸氨基肽酶对天冬氨酸氨基肽酶有代偿作用。缺失另外两种氨基肽酶基因的虫株均有对不同荧光底物讲解能力下降的现象。综上诉述，本项目探讨了多种氨基肽酶的功能活性，并评价了其作为药物靶点的可行性，基本达到了项目的预期目标。

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