立体电子效应调控的高灵敏双光子荧光探针设计及其在脑血管硝化应激损伤研究中的应用

Peroxynitrite (ONOO-) is a highly reactive, short-lived species that is one of the key mediators of reperfusion injury associated with stroke. To fully understand ONOO- biology in vascular damage, it is important to have an efficient tool available that can realize the real-time tracing of endogenous ONOO- fluxes. In our previous work, a highly sensitive and specific fluorescent probe (NP3) has been developed to image ONOO- in live cells. Although NP3 has many advantages such as low cytotoxicity and good brain-blood barrier permeability besides its good sensitivity and high specificity, its blue-emission has limited its application in the imaging of intact whole mouse brain in real time. Here in this proposal, we present evidence that probe NP3 is a good start point for novel two-photon near-infrared (NIR) ONOO- fluorescent probe development. The specific aims of the present proposal are the following: (1) developing novel drug-like ONOO- probes with efficient two-photon excitation ability, NIR emission profile, and desirable pharmacodynamics and pharmacokinetic (PK) properties. Additional aim of the current submission is (2) to develop an assay for the direct visualization of ONOO- fluxes in live mice with the newly developed probes.

过氧化亚硝酸阴离子（ONOO-）是脑卒中发生发展过程中的重要生物标志物之一。发展对其进行实时在体检测的方法，不仅可示踪脑血管损伤病理进程，而且可推动脑血管病理分子机制研究及创新药物发现，意义重大。本项目拟在前期研究中发展的ONOO-高特异灵敏性荧光探针NP3结构基础上，针对其双光子激发效率低、发射光组织穿透能力差，不能用于活体动物无损观测的问题，在类药性及荧光原理的双重指导原则下开展以下研究：（1）通过对荧光团的系统结构改造，发展具有良好血脑屏障透过能力、高效双光子激发特性、近红外发射的新型荧光团；并利用立体电子效应进一步优化探针特异灵敏性；构建具有良好血脑屏障通透性等药代动力学性质的新型高灵敏双光子ONOO-荧光探针；（2）利用该探针实时监测活体小鼠脑血管损伤过程中的硝化应激动态变化过程。本项目将为脑血管病分子机制研究、药物筛选及药效评价提供新型探针工具。

过氧化亚硝酸阴离子（ONOO-）是脑卒中发生发展过程中的重要生物标志物之一。发展对其进行实时在体检测的方法，不仅可示踪脑血管损伤病理进程，而且可推动脑血管病理分子机制研究及创新药物发现，意义重大。本项目基于前期研究发展的ONOO-高特异灵敏性荧光探针NP3，针对其双光子激发效率低、发射光组织穿透能力差，不能用于活体动物无损观测的问题，开展了系统研究工作：（1）采用“共轭延长”及“稳定酮式共振”策略，对荧光团进行了系统结构改造，得到两类具有近红外发射的新型类似物并总结了结构-荧光性质关系；确认了其活细胞染色能力；并评价其透过BBB能力；（2）针对新荧光团透BBB能力弱的问题，采用“理化性质导向”筛选策略，寻找到能透BBB的苯并BODIOY荧光团，并利用该荧光团构建了具有良好血脑屏障通透性的新型高灵敏双光子ONOO-荧光探针B545b；实时监测了活体小鼠脑血管损伤过程中的硝化应激动态变化过程，发现血管损伤产生的ONOO-处于损伤早期阶段；（3）基于上述探针研究中总结的构效关系，发展了ONOO-酸级联响应探针，发现脑血管损伤中产生的ONOO参与诱导自噬；（4）利用项目进展中发现的具有较好肾脏分布性质的荧光团，构建了肾靶向性ONOO探针，发现该探针在小鼠模型中早于血清肌酐法至少24小时检测到顺铂导致的急性肾损伤。本项目为硝化应激损伤检测提供了系列探针工具，并初步说明ONOO是灵敏指示早期脑血管、急性肾损伤的标志物。

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