发展化学蛋白质组学平台用于筛选天然产物的靶蛋白

Natural products are well-recognized as a gold mine in drug discovery. Identification of protein target(s) of natural products is an essential step as well as a bottle neck in drug discovery process. Traditional methods to identify protein target(s) and characterize the natural produt-protein target interactions requires either extensive chemical derivatization of the parent compounds or over-expression of exogenous recombinant proteins, which usually damages probe activity, permeability or protein conformation. Therefore, it remains a challenging task to identify protein targets under physiological condition in high throughput. To solve these problems, the proposed project aims to develop a novel chemical proteomics technology and enable profiling of protein targets of natural products in live cells without having to modify parent compounds extensively. Furthermore, the affinity between natural products and protein targets will be measured using quantitative mass spectrometry analysis. Core techniques include: (1) design of chemical probes that are mass spectrometry-compatible, bioactive and cell-permeable (2) Tailor-made target-profiling strategies for a single natural product and an array of natural products (3) Standardized protocols of quantitative proteomics for protein abundance measurement (4) Methods for measuring affinity between natural products and protein targets. We propose to build an integral technology platform for protein target screening which will greatly facilitate elucidation of mode of action (MoA) of natural products as well as drug discovery.

天然产物被公认为是新药研发的珍贵宝藏。在新药研发的过程中，筛选靶蛋白是一个重要环节，也是最具挑战性的瓶颈。传统方法筛选靶蛋白和研究天然产物-靶蛋白相互作用需要对天然产物通过化学合成添加位阻较大的亲和标签，或者需要外源表达多个重组蛋白，存在着丧失母分子活性，不能模拟活体环境，以及难以进行高通量筛选等问题。针对上述困难，本项目拟发展一种基于高分辨质谱的技术平台，实现在活体内，不过度修饰天然产物的前提下，高通量筛选多个天然产物的靶蛋白（群）并进一步量化天然产物-靶蛋白的亲和度。其核心技术包括：（1）设计与质谱鉴定兼容的活性、透膜的化学探针；（2）分别针对单个或多个天然产物设计的个性化策略；（3）比较靶蛋白丰度的定量蛋白质组学标准化流程；（4）测定靶蛋白-天然产物亲和度的定量分析法。通过本项目实施，有望建立靶蛋白筛选的集成化学蛋白质组学平台，为解析天然产物药理毒理和新药研发提供有力的技术支撑。

传统方法研究小分子的靶蛋白需要对小分子化合物添加亲和标签来获得化学探针。这一流程存在多个困难，例如化学合成复杂耗时、标签的位阻较大容易使探针丧失活性，不能模拟活体环境，以及难以进行高通量筛选。针对上述难点，本项目发展了一种基于高分辨质谱的技术平台实现高通量筛选多个小分子的靶蛋白。研究主要内容包括：（1）设计与质谱鉴定兼容的活性、透膜的化学探针；（2）优化富集靶蛋白的定量蛋白质组学流程；（3）确定与小分子直接结合的靶蛋白并研究其相互作用的生物学意义。研究发现，使用互补的探针IAA和EBX组合，能够广泛标记多个含有活性半胱氨酸的靶蛋白。我们进一步优化了基于“点击化学”的富集靶蛋白的流程，提高鉴定小分子靶蛋白的效率。最后，我们应用最优方法，筛选了多个小分子化合物的蛋白靶点，包括雷公藤红素、醉茄素A等多个天然产物。我们进一步将该方法拓展用于研究环境污染物全氟辛酸，鉴定其作用靶点并解释了它的毒理机制。对于新发现的小分子-靶蛋白相互作用，我们开展了一系列的验证实验，证实新发现的可靠性。本研究不仅针对多个小分子发现了新的靶蛋白从而解释了其作用机制，也提供了一种行之有效的化学蛋白质组学方法，将来可用于高通量研究作用于半胱氨酸的活性小分子。

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