tmRNA和smpB蛋白介导的反式翻译的作用机制研究

由tmRNA和smpB蛋白介导的反式翻译是细菌内的一种特殊翻译模式， 也是经典翻译的补充途径。它对提高细菌在逆境下的生存能力、维持病原菌的致病能力等发挥重要作用。tmRNA 缺少反密码子序列，且滞留核糖体A位中无mRNA，目前人们对smpB是如何帮助tmRNA进入核糖体，并发挥作用的分子机理尚不清楚。申请者最近发现，smpB羧基末端保守氨基酸扮演了类似tRNA中反密码子环的角色，这可能是介导反式翻译发生的关键原因。本项目拟在此基础上，通过定点突变、交联反应、toe-printing等方法，在smpB蛋白中导入人工氨基酸，精确鉴定smpB与核糖体、tmRNA作用的关键位点，借助圆二色谱、cryo-EM、NMR等技术观察复合物构象的变化，基本弄清tmRNA/smpB与滞留核糖体识别的作用机制。所获研究成果不仅对丰富生物化学理论具有重要意义，而且对于寻找细菌性疾病治疗的新型靶点有潜在的应用价值。

反式翻译是拯救滞留核糖体的主要方式，由核心元件tmRNA和SmpB介导，在缓减逆境细胞的压力饥饿状态、保持病原菌致病能力、细胞循环和分化等多方面发挥作用（Une M, et al. 2009）。SmpB作为tmRNA结合蛋白，在信息传递中扮演重要的角色（Keiler KC. 2008）。首先，SmpB蛋白和tmRNA结合，促进tmRNA装载丙氨酸，然后与EF-Tu、GTP形成四级复合物，进入到核糖体A位点；其次，SmpB尾部诱使核糖体构象变化，导致了EF-Tu激活、GTP水解，最后tmRNA上编码框实现翻译拯救。但整个反式翻译发生过程中，SmpB蛋白中特定氨基酸与核糖体、tmRNA的作用方式、作用位点还不清楚。为此，本项目采用定点突变、基因表达、交联反应、toe-printing 等方法，精确鉴定SmpB 与核糖体、tmRNA 作用的关键位点。结果发现，① SmpB蛋白K133和核糖体16s DNA中G1392作用，R153和核糖体16s DNA中C422/T512/A535作用；② SmpB作用于tRNA-like domain（TLD）中G319和T16位置；③ 除圆满完成项目规定的研究内容外， 我们首次证实，维氏气单胞菌中tmRNA对菌株的高毒力至关重要，tmRNA可能调节Bvgs-RR启动子。所获研究成果，对于阐明反式翻译的作用机制，有积极的意义；也对进一步丰富tmRNA的表达调控理论，特别是作为小分子RNA发挥调节作用打下基础，为系统研究tmRNA在病原菌的致病机理中重要角色、寻找细菌性疾病的治疗靶点提供技术支持。.所获相关研究成果在国内核心以上刊物上正式发表论文5篇，其中包括SCI源刊物3 篇，还有 2 篇 SCI 论文尚在整理之中;授权专利1项。同时，在项目执行期间，项目组成员参加国内外学术会议 17人次，提交会议摘要 8篇，做口头报告 3 个、培养研究生4 名。研究成果达到合同书所拟定的在国内外核心以上刊物发表论文 3-5 篇（其中SCI源期刊2-3篇），培养硕士研究生3-4 名的预定目标。

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