锌调蛋白Zur识别两类靶标DNA的结构基础

Zinc is an abundant transition metal essential for almost all living organisms as it plays important roles in a wide range of cellular processes. However, too much zinc is harmful to the cells. The organisms therefore must control the cellular zinc concentration at an appropriate level. Bacteria usually maintain their zinc homeostasis by the zinc uptake regulator (Zur), which represses the zinc uptake system. Our previous work showed that the Zur of Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), the crucifer black rot pathogen, could not only directly repress the expression of the zinc uptake system but also directly activate the expression of the zinc export system at the transcriptional level. This project plans to determinate the crystal structures of the complexes between the Zur and its four target DNA molecules, three of which were derived from the zinc uptake system and one from the zinc export system. The results will elucidate the molecular basis by which Zur recognizes its two types of target DNA molecules, providing valuable insights into our understanding of the molecular mechanisms by which Zur regulates the zinc homeostasis.

锌是一种至关重要的大量过渡金属元素，它在几乎所有生物的很多生命过程中发挥着重要的作用。锌离子浓度过大对细胞会有毒害作用，因此，正常的生物必须能控制体内的锌离子浓度在一适当的水平。细菌通常通过可以抑制锌吸收系统的锌调蛋白Zur（zinc uptake regulator）来维持细胞内锌离子浓度的稳态平衡（zinc homeostasis）。我们发现十字花科黑腐病菌（Xcc）的Zur蛋白不仅能直接抑制锌离子吸收系统的转录也能直接激活锌离子排放系统的转录。本项目计划测定Xcc Zur蛋白与它的4个靶标DNA分子（其中3个来源于锌离子吸收系统，另外1个来源于锌离子排放系统）的复合体晶体结构，解释Zur蛋白识别不同靶标DNA的结构基础，并在分子水平上揭示Zur的调控机理。

背景：锌吸收调控蛋白Zur（zinc uptake regulator）是铁吸收调控蛋白Fur（ferric uptake regulator）家族的成员，在维持细菌锌离子稳态和毒性过程中发挥重要作用。Zur蛋白通过感知细胞内的锌离子，特异性结合锌离子响应基因的启动子区，调控相关基因的转录。然而，锌离子如何被感知并介导的Zur激活转录机制仍不清楚。本研究中，我们探究了十字花科黑腐病菌锌调蛋白XcZur在锌离子存在条件下诱导激活并识别DNA的结构机制。.内容：我们使用序列比对及系统进化树构建探究XcZur在同源蛋白家族中的保守性及序列特异性；使用蛋白表达纯化及晶体结构解析，位点特异性突变体构建，凝胶迁移实验（EMSA）及电感耦合等离子体质谱实验（ICP-MS）解释XcZur识别靶标DNA的结构基础；使用尺寸排阻色谱实验（SEC）探究溶液状态下XcZur的聚集状态；使用胰蛋白酶水解实验及氢氘交换实验（HDX-MS）探究溶液状态下锌和DNA诱导的XcZur的构象变化。.结果：本研究首先解析了2.2-Å分辨率的Apo XcZur晶体结构。我们发现Apo XcZur只在其结构性锌离子结合位点结合了一个锌离子，说明该蛋白在锌离子结合到调节性位点之前呈现封闭的失活状态，不能结合DNA。我们随后解析了1.9-Å分辨率的Holo XcZur晶体结构，此时蛋白的结构性和调节性位点同时被锌离子占据。与Apo XcZur的构象截然不同，Holo XcZur呈现一种开放的激活状态，可以直接结合DNA。进一步的结构比对和氢氘交换质谱（HDX-MS）分析发现，锌离子在调节性位点（由铰链区，二聚结构域和DNA结合结构域组成）的结合驱动了XcZur从封闭到开放的构象变化，这对于XcZur的激活至关重要。这种金属离子诱导的构象激活机制非常新颖，因为人们通常认为Fur家族成员在感受金属离子的过程中倾向于发生从开放到封闭的构象转变。HDX-MS和生化实验结果进一步表明，后续过程中holo XcZur与DNA结合是一个相互诱导契合的过程。.意义：我们的工作为深入理解锌离子如何诱导XcZur激活并介导其DNA识别提供了重要基础，这些机制可能可以推广到Fur家族其他成员的工作过程。

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