肺组织CD8T细胞免疫学特性及其在结核病发生发展中的作用

Lack of vaccines is a key cause of the current severe tuberculosis epidemic. CD4 T cells play an important role in anti-tuberculosis immunity, but vaccines that target CD4 T cell immunity have failed in clinical trials without exception. By single-cell transcriptome and T cell receptor (TCR) sequencing technology, we first found that clonetypes were significantly expanding in CD8 T cells, not CD4 T cells, in pleural fluid from tuberculosis. The same TCR from CD8 T Cells can differentiate into a variety of different phenotypes including CTL-like new subtypes in pleural fluid, compared to peripheral blood. Hereby, we propose that CD8 T cells play a key role in the immune protection of tuberculosis. This study focuses on revealing the immune characteristics of CD8 T cells and/or specific subpopulations in lung tissue and their roles in the Pathogenesis of Tuberculosis by using single cell sequencing, high-throughput tissue antigen analysis (CODEX), in situ single-cell mass spectrometry analysis and other techniques. We will further elucidate its cellular network and metabolic mechanisms of tuberculosis-specific CD8 T cell responses. This will provide new theoretical and technical support for accelerating the development of effective tuberculosis vaccines.

缺乏疫苗是导致当前结核病严峻疫情的关键原因。CD4T细胞在抗结核免疫中起着重要作用，但以诱导CD4T细胞免疫为目标的疫苗在临床试验中无一例外的宣告失败。借助单细胞转录组和TCR组库同步分析技术，我们首次发现，在结核感染局部显著克隆扩增的是CD8T细胞，而不是CD4T细胞；与外周血比较，感染局部克隆扩增的CD8T细胞可以分化为包括CTL样新亚型在内多种不同表型。据此，我们提出，在CD4T细胞之外，CD8T细胞在结核免疫保护中起着关键重要作用的假说。本项目拟整合单细胞测序、高通量组织抗原分析（CODEX）、原位单细胞质谱组分分析等技术，解析肺组织中CD8T细胞和/或特定亚群的免疫特性与结核病发生发展的内在联系，明确其在宿主抗结核保护免疫中的作用，阐明其在宿主具体的作用机制以及调控结核菌特异性CD8T细胞应答的细胞网络和代谢机制。从而为加速有效结核疫苗研发提供新理论和技术支撑。

CD4 T 细胞免疫在抗结核保护性免疫中起着关键作用，但基于CD4 T细胞免疫为目标而研发的疫苗在临床试验以失败告终。我们前期通过单细胞转录组和TCR 免疫组库发现，除CD8 T细胞外的其他亚群中很少有显著扩增的 T细胞克隆，T细胞克隆主要归属于CD8 T细胞亚群，证实CD8 T细胞在结核感染组织克隆扩增，并分化出不同的细胞表型，我们提出结核感染中CD8 T细胞和/或其亚群在结核免疫保护中起着关键作用。本项目围绕上述假说，首先收集肺结核病人感染组织，利用单细胞测序揭示结核感染组织中CD8 T细胞的异质性及其免疫特征，发现GZMK+ CD8 T细胞显著在结核感染组织中富集；揭示结核感染组织中CD8 T细胞在表型、克隆扩增、细胞发育分化等方面与外周血显著不同。在小鼠感染肺组织单细胞测序转录组也证实肺组织中GZMK+CD8 T细胞的表达增加，并伴随着GZMB+CD8 T细胞的减少。通过多色免疫荧光OPAL建立基于CD20 B细胞、CD68巨噬细胞肉芽肿中心分布情况的结核肉芽肿分型，发现CD8 T细胞与III、IV型肉芽肿发生密切相关；采用多重免疫荧光CODEX证实表达不同GZM的CD8在空间分布方面存在显著不同，明确结核患者肺组织中CD8 T细胞应答。结合单细胞质谱技术和单细胞代谢组分析阐明结核菌感染重塑小鼠肺组织CD8 T细胞代谢网络；通过建立临床队列利用流式细胞术，我们发现胸腔积液中GZMK+CD8 T细胞的比例显著增高具有结核疾病特异性，并与病情转归相关；体外实验表明GZMK+细胞具有杀菌功能以及细胞毒性。我们的结果表明，CD8 T 细胞和/或其亚群的免疫特性在宿主抗结核免疫起着关键作用，基于CD8 T细胞的结核病免疫保护评价体系，可能为推进结核病疫苗研发的理论和应用技术提供新思路。

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