玉米光合固碳途径关键酶PPDK调节蛋白PDRP的双功能调控机制研究

PPDK (Pyruvate orthophosphate dikinase) is a rate-limiting enzyme in the carbon fixation cycle of C4 plants. Its activity has direct influence on carbon assimilation rate. PDRP (PPDK regulatory protein) is a unique bi-functional enzyme that has both phosphatase and kinase activities. PDRP can regulate PPDK activity via light-dependent, reversible phosphorylation of PPDK. It has been reported that PPDK activity can be affected by light intensity, temperature and CO2 concentration. However, the mechanism underlying the regulation of the bi-functional PDRP activity, which would result in the regulation in PPDK activity, is still not clear. Our team has primary found two phosphorylation sites in PDRP, which indicated that PDRP activity might be regulated via phosphorylation modification. Here we take maize as research material and will further investigate the regulatory role of PDRP in the C4 cycle by knocking out PDRP in maize through CRISPR technology. We will also investigate the functions of the two previously identified phosphorylation sites regarding the enzyme activity of PDRP through inducing site mutation, screen for the kinase and phosphatase that catalyze PDRP trough protein-protein interaction investigation and determine the co-crystal structure of PPDK-PDRP. Combining the above genetic, molecular and biochemical methods, we aim to elaborate the bi-functional and regulatory mechanism of PDRP in C4 photosynthesis and reveal its regulation network. Our findings would further supply the theoretical foundation for increasing maize photosynthetic efficiency.

PPDK（丙酮酸磷酸双激酶）是C4植物光合固碳途径中的限速酶，其活性高低直接影响碳同化速率。PDRP（PPDK调节蛋白）具有磷酸酶和激酶双重功能，可逆地磷酸化PPDK来调节其活性。PPDK的活性受光强、温度和CO2浓度调控，但何种机制调控PDRP的双功能酶活性，从而调控PPDK的活性目前尚不清楚。本项目组前期发现PDRP上存在两个磷酸化位点，暗示其活性可能受磷酸化修饰的调控。本研究拟以玉米为研究材料，通过CRISPR技术敲除玉米PDRP基因，对PDRP在C4途径中的调控功能进行深入研究；利用点突变手段检测两个磷酸化位点对PDRP酶活的影响；利用蛋白互作技术筛查PDRP的蛋白激酶和磷酸酶，并对其功能进行研究；解析PDRP和PPDK的共结晶结构，进一步阐释PDRP双功能酶的分子机制。通过遗传、生化和分子手段来探究PDRP在C4光合作用中的功能及调控机制，为增强玉米的光合作用效率提供理论基础。

PPDK（丙酮酸磷酸双激酶）是玉米NADP-ME途径的关键酶，其活性高低直接影响碳同化速率。PDRP（PPDK调节蛋白）具有磷酸酶和激酶双重功能，通过可逆地磷酸化PPDK来调节其活性。利用基因编辑技术彻底敲除玉米PDRP，结果造成胚胎致死或幼苗期致死的表型，因此本项目制备了 ZmPDRP-RNAi 和 ZmPPDK-RNAi的转基因植株，并对其进行表型观察及光合参数的检测。当PDRP或PPDK的表达被抑制时，株高明显矮于野生型。通过夏季和冬季分别在田间和温室测量光合参数，发现突变体由于PDRP的表达量被抑制，从而影响了PPDK的固碳效率，转基因玉米的光合速率低于野生型，在光照强度从弱到强的过程中均可以保持这个趋势，由于PDRP和PPDK在玉米中含量远远高于植物生长所需的基本含量，所以虽然表达被显著抑制，但仅造成效率变低，不会导致突变体有明显的生长发育缺陷。通过对一天中不同时间点的玉米成熟叶片样品进行蛋白质组质谱检测，分析PDRP和PPDK与光强和生长周期的关系，发现了PDRP和PPDK共35个新磷酸化位点，表明PPDK的酶活性及其调控机制非常复杂。C3植物水稻和C4植物玉米各自基因组内编码的PPDK和PDRP的基因序列序列相似性很高，结合水稻PDRP和PPDK进行酵母双杂交验证了PPDK和PDRP之间存在相互作用。对PPDK进行系统进化分析，发现PPDKB是PPDK基因的祖先基因，在禾本科的C3植物和C4植物分化之前发生了一次重复事件，产生了另一个基因PPDKA。水稻和玉米分化之后，玉米祖先基因组中丢失了PPDKA拷贝，而PPDKB基因进一步发生了重复，故玉米ZmPPDK1、ZmPPDK2和水稻OsPPDKB皆源于PPDKB。以上发现有利于我们更加深入了解C4植物光合固碳机制的调节，发掘更有效的提高植物光合效率的方式，从而进一步提高农作物产量。

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