基因组为pgRNA的HBV病毒样颗粒形成机制的研究

Nucleot(s)ide analogues (NAs) can block the process of reverse transcription during hepatitis B virus (HBV) replication, and inhibit the formation of HBV rcDNA. Recently, it has been proved that the half-life of HBV covalently closed circular DNA (cccDNA) is not as long as previously described. Since the supplement of cccDNA pool can be blocked by NAs, theoretically, HBV cccDNA can be exhausted and chronic hepatitis B (CHB) could be clinically cured after the prolonged NAs treatment. However, the rate of clinical cure for CHB is extremely low. It has been confirmed the presence of HBV RNA in the serum of HBV infected patients by others and our lab. Our recent data further showed that serum HBV RNA could be HBV pregenomic RNA (pgRNA), which was nucleocapsidated and present in HBV virions. Thus, we speculated that HBV may be consist of both Dane’s particle and HBV pgRNA virions which may have the same potential infectious ability as Dane’s particle. Since NAs only can block the process of reverse transcription, it will not be able to inhibit the production of HBV pgRNA virions. Therefore, we suggest this might be one of the factors contributed to the difficulty in eradicating HBV by NAs treatment. This study will explore the natural characteristics, origin and the potential clinical significance of HBV RNA in serum.

核苷（酸）类似物（NAs）可有效阻断HBV复制的逆转录和松散环状DNA（rcDNA）合成，进而阻断cccDNA池的补充。近期研究揭示HBV cccDNA的半衰期较短，理论上长期用药应能通过耗竭cccDNA实现慢性乙型肝炎（CHB）的临床治愈。然而，接受NAs治疗的CHB治愈率极低。HBV被公认为DNA病毒，但本室和其他实验室均证实患者血清中存在HBV RNA。我们进而发现，存在于血清中的HBV RNA可能为前基因组RNA（pgRNA），并存在于HBV病毒样颗粒中。我们推测，除丹氏颗粒外，HBV还存在基因组为pgRNA的病毒样颗粒，该病毒样颗粒可能带有与丹氏颗粒一样的包膜蛋白，因此具有潜在感染性。由于NAs类药物不能抑制pgRNA病毒样颗粒的产生及再感染，导致NAs药物难以临床治愈CHB。本课题将进一步探索血清HBV RNA的存在形式、产生机制，并通过临床队列研究揭示其潜在的临床意义。

前期课题组和其他实验室均发现慢乙肝患者血清中存在HBV pgRNA病毒样颗粒，其潜在临床意义仍不清楚。本课题旨在通过分子生物学、细胞生物学以及临床队列，系统性研究血清HBV RNA的存在形式、形成机制及其临床意义。.本研究通过5’-RACE、蔗糖密度梯度离心、电镜观察、western blot和荧光定量PCR等实验，证实血清中的HBV RNA为包裹在核衣壳内未经或部分逆转录的pgRNA。其次，证实患者血清中的HBV RNA除了完整pgRNA外，主要为其剪切变异体和3’末端截短体。通过设计HBV rcDNA、PreC/C、S和X区检测引物，证实在核苷（酸）类药物（NAs）治疗情况下，NAs竞争掺入并导致3’端截短的HBV单负链DNA和pgRNA形成；并发现NAs治疗下CHB患者血清HBV RNA水平X、S、PreC/C区呈依次升高趋势，而血清HBV DNA趋势与HBV RNA相反。并证实NAs治疗导致血清中HBV DNA多为仅有5’端部分的不可逆延伸终止片段，而HBV RNA主要为3’末端截短体，两者均为复制缺陷型HBV，该研究为NAs预防母婴垂直传播临床应用提供理论依据。此外，本研究还提出了更新的隐匿性HBV感染（OBI）定义，并建立了能排除整合HBV DNA对HBV复制全能性的rcDNA/cccDNA检测的干扰的跨缺口PCR扩增技术并获专利授权。.临床意义方面，阐明了慢性HBV 感染患者自然史不同病程HBV RNA水平分布。证实HBeAg阳性慢性感染者中血清HBV RNA与DNA、HBsAg和肝组织内cccDNA正相关，并提出血清总核酸（HBV DNA+RNA）能更好反映肝组织内cccDNA活性。另外，在接受长效干扰素和NAs治疗后实现HBV DNA和HBsAg转阴患者的停药点血清HBV RNA可预测HBsAg和/或HBV DNA复阳风险。此外，长期接受NAs治疗的慢乙肝患者血清HBV DNA低于检测下限后，HBV RNA和HBcrAg水平相关性较高，两个指标仍可反映病毒复制状态。HBV RNA和HBcrAg下降幅度更大的患者更易发生HBeAg血清学转换，且HBV RNA消失早于HBcrAg，并提出“准临床治愈”（病毒学治愈）的概念。.综上所述，本研究明确了患者血清HBV RNA的存在形式和形成机制，并阐明了血清HBV RNA临床实践中的潜在意义。

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