对硝基苯甲酸选择性抑制分枝杆菌生长机制的研究

对硝基苯甲酸（PNB）选择性培养基鉴别结核杆菌复合群和非结核分枝杆菌技术在全球广泛使用。关于此技术的工作原理却鲜有人研究，仅有的报道是1954年日本学者发现鸟分枝杆菌能够将对细菌有毒性的PNB还原为对氨基苯甲酸（PABA），已知PABA是细菌合成叶酸必的需成分。对氨基苯甲酸还原酶机制是否是PNB选择性培养基的工作原理？此酶的编码基因如何？编码基因是如何调控的？以上问题没有人进行过研究。而申请人在长期实践中，发现PNB选择性培养基法存在一些个例情况，即约1%结核杆菌复合群能够在PNB培养基上生长，而又有少量非结核分枝杆菌不能耐受PNB，这些现象的发生机制如何？这种个案涉及的细菌是否是一个特定的细菌亚种？本研究希望通过分子生物学技术、生物化学技术，和微生物学技术对上述问题展开研究，以期阐明PNB用于初步鉴定分枝杆菌的机制；并通过对个案的研究，希望完善此项技术，提高其准确性。

目前在全球应用最为普遍的鉴别结核分枝杆菌复合群（MTC）与非结核分枝杆菌（NTM）的方法是含对硝基苯甲(PNB)的鉴别培养基法。但关于PNB选择性培养基用于鉴别MTC与NTM的机制研究报道甚少。.本研究选取了38株不同种的分枝杆菌标准菌株，应用HPLC和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对PNB的代谢产物进行鉴定，结果发现对氨基苯甲酸（PABA）是PNB的代谢产物之一。本研究中的所有NTM菌株均可将PNB还原为PABA，而MTC则不具备该能力。快速鉴别MTC与NTM对结核病的诊治具有重要意义，但常规的实验室方法费时费力。依托本课题建立了一种简便、廉价的应用分光光度计直接测量PNB代谢产物来鉴别MTC与NTM的方法。并应用此方法对38株MTC与NTM的标准株和65株临床分离株（包含10种分枝杆菌）对该方法进行了评价。结果表明应用分光光度计检测PABA来鉴定MTC与NTM具有100%的敏感性和100%的特异性。.关于硝基苯甲酸还原酶的编码基因，在各种分枝杆菌中还未进行基因定位，本研究采用生物信息学方法对脓肿分枝杆菌中被注释为“putative nitroreductase”的基因进行了预测分析，结果显示该基因编码219个氨基酸；对应的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质（不稳定系数为54.52，总平均亲水性为-0.244）；理论分子量和等电点分别为24.38 KDa和6.52；蛋白质二级结构以 -螺旋、 -折叠和无规卷曲为主要构件；氨基酸序列与蛋白质结构数据库中3gr3蛋白A链的相似性最高为60%，空间结构预测表明该蛋白是硝基还原酶家族成员之一，可能具有还原对硝基苯甲酸的功能。.利用大肠杆菌表达系统对“putative nitroreductase”基因进行了体外表达，目的蛋白以包涵体形式存在；采用亲和层析方法对包涵体蛋白进行了纯化，并通过透析复性处理，得到了可溶性的目的蛋白；灰度扫描分析结果显示其纯度为89.6%；Western blot结果显示在约30KDa处得到了显色带，且特异性较好；BCA蛋白定量法测得其浓度为0.59 μg/μL；酶的比活力为32.2U/mg。.总之，本研究确定了PNB选择性培养基用于鉴别MTC与NTM的机制，并确定了脓肿分枝杆菌中“putative nitroreductase”基因的硝基苯甲酸还原酶活性。

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