NK-92细胞介导溶瘤腺病毒靶向治疗实体肿瘤的研究

肿瘤转移是临床所面临最棘手的问题之一，目前治疗手段十分有限。我们获得小额资助的国基金研究了以NK细胞作载体细胞介导5/F35嵌合型溶瘤腺病毒靶向治疗肿瘤的体外动力学特征，证实NK细胞能介导溶瘤腺病毒产生体外抗肿瘤效应。但研究发现5/F35嵌合型腺病毒尽管对人外周血来源NK细胞有较高的感染效率（40-50%），但仍然无法满足应用之需要；此外，溶瘤腺病毒从NK细胞的释放需要提供外源性E1A，从而导致对技术和设备的要求较高。本研究拟就如何改进上述存在问题展开深入研究，通过对具有较强抗肿瘤活性的NK-92细胞进行基因修饰和改造，以期显著提高腺病毒对NK-92细胞的感染效率、简化病毒释放过程以及增强NK-92细胞体内肿瘤靶向性，并就NK-92细胞介导溶瘤腺病毒抗肿瘤效应的体内动力学和机制深入探讨，为NK细胞介导溶瘤腺病毒治疗肿瘤（特别是肿瘤出现转移）策略向临床的转化应用提供坚实的理论基础和实验依据。

病毒-细胞治疗是一种新型肿瘤治疗方法，联合溶瘤病毒和细胞载体可有效克服病毒免疫源性强及肿瘤靶向性低，从而增强溶瘤病毒抗肿瘤活性。溶瘤腺病毒作为溶瘤病毒的一种具有溶瘤效果好、安全性高和制备方便等优点，但存在免疫源性高和肿瘤靶向性低的弱点。本研究探讨基因改造的NK-92细胞作为溶瘤腺病毒的转送载体在降低溶瘤腺病毒免疫源性和增强肿瘤靶向性的作用。首先构建了一系列的复制缺陷型和溶瘤腺病毒载体、多株基因修饰的肿瘤细胞株，但在对NK-92细胞基因工程改造过程中，细胞不能长期培养及将编码腺病毒柯萨奇受体（CAR）的逆转录病毒感染NK-92细胞后细胞容易死亡，无法获得克隆生长。在NK-92细胞基因改造失败的情况下，采取两种替代策略：一是用微颗粒作为载体转送溶瘤腺病毒。微颗粒是由细胞衍生、大小0.1-1 uM的天然颗粒，不仅含有细胞来源各类生物分子，还能将这些分子从一个细胞转送至另一个细胞，已证实肿瘤来源的微颗粒包裹化疗药物能有效地产生抗肿瘤效应，利用肿瘤来源的微颗粒亦能很好地包裹溶瘤腺病毒。与单纯的溶瘤腺病毒相比，微颗粒包裹的溶瘤腺病毒能更有效地杀伤各类肿瘤细胞，其机制是微颗粒介导溶瘤腺病毒以CAR非依赖方式进入肿瘤细胞，并能将腺病毒直接转送至肿瘤细胞核内，使溶瘤腺病毒的复制能力显著提高；利用腺病毒中和抗体能完全阻断单纯的溶瘤腺病毒感染各类肿瘤细胞，却不能阻断微颗粒包裹溶瘤腺病毒的感染，表明微颗粒能阻断中和抗体对腺病毒的作用。在多种肿瘤皮下接种、腹腔种植的裸鼠以及免疫正常小鼠中，微颗粒包裹的溶瘤腺病毒与单纯的溶瘤腺病毒相比显示更强的抗肿瘤活性，并不受中和抗体的影响。此外，微颗粒包裹的溶瘤腺病毒较单纯的溶瘤腺病毒更有效地杀伤肿瘤干细胞。二是对白血病K562细胞进行多基因修饰，使其表达CAR、E1A和多种趋化因子受体，以此作为溶瘤腺病毒的细胞载体。体外实验证实，低滴度的溶瘤腺病毒能有效感染多基因修饰的K562细胞，并在感染细胞后产生有效的复制从而导致细胞的溶解。将表达荧光素（Luc）的溶瘤腺病毒感染多基因修饰的K562细胞和单纯表达Luc的溶瘤腺病毒分别尾静脉注射至皮下接种肿瘤的裸鼠体内，24小时后取出皮下肿瘤检测Luc的表达。结果显示：细胞载体组可在皮下肿瘤中检测到Luc高水平表达，而单纯的溶瘤腺病毒组Luc则检测不到或极低水平表达，表明多基因修饰的K562细胞具有明显的肿瘤靶向性。

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