含FRG1基因突变体的先天性马蹄内翻足疾病iPS细胞模型的建立及发病机制的初步探讨

The diversities of inheritance pattern and clinical manifestation of congenital clubfoot (CCF) indicated a few genes might be involved in the pathogenesis of CCF through different mechanisms. Up to now, there is no other gene defined to be CCF-causing gene besides of PITX1 gene. Our prelimenary data showed that a CCF-Xi'an family is recessive inheritance which is rare in the pathogenesis of CCF. Furthermore, the exome sequencing result indicated that compound heterozygous FRG1 mutation is disease-causing mutation. However, it remains unclear that how compound heterozygous FRG1 mutation leads to CCF and the underlying mechanism is still unknown. This study plans to reprogram cells from urine samples by inducing 4 factors to generate CCF-iPSCs and control iPSCs. When these iPS cell lines are induced to different cell lineages, we will compare and analyze cell phenotype and find the disease-causing cell origin. Furthermore, we will detect and clarify the molecular mechanism leading to CCF by analyzing the interaction between FRG1 and CUX1 and mRNA expression profile. Capturing deficient cells and studying these dysfunctional cells will enrich our understanding on CCF and it will have a theoretic significance to exploring the pathogenesis of CCF.

先天性马蹄内翻足（CCF）遗传方式及临床表现的多样性表明多种基因通过不同分子机制引发CCF。目前除PITX1基因外，未明确其他基因突变与CCF发病有关。本课题组前期工作中，发现CCF-Xi'an家系具有CCF患病少见的隐性遗传方式，外显子测序发现，复合性杂合FRG1基因点突变是其致病原因，但FRG1基因突变如何引发CCF的发生，尤其是细胞和分子机制均不清楚。本课题拟利用CCF-xi'an家系成员尿液中脱落细胞，慢病毒四因子转染制备疾病特异CCF－iPSCs和对照iPSCs，诱导它们向不同靶细胞系分化，观察分化后细胞表型的异同，明确引发CCF致病的细胞机制；并通过对FRG1-CUX1相互作用及细胞表达谱的分析，明确此复合性杂合FRG1点突变引发CCF发生的分子机制。通过捕获缺陷细胞并探求其细胞功能障碍，有助于增加对该疾病病理的理解，对CCF病因学的理解具有理论意义。

先天性马蹄内翻足（CCF）遗传方式及临床表现的多样性表明多种基因通过不同分子机制引发CCF。本课题组在临床发现了一个CCF-xi'an 家系具有CCF 患病少见的隐性遗传方式，外显子测序发现，复合性杂合FRG1 基因点突变是其致病原因，为了探究FRG1 基因突变如何引发CCF 的发生，细胞和分子机制分别是什么，课题组利用家系成员（n=3）尿液脱落细胞，用仙台病毒四因子转染制备成马蹄内翻足疾病特异CCF-iPSCs，再将正常人群（n=3）的尿液脱落细胞制备成NC-iPSCs作为对照，在体外利用分化培养基诱导它们向神经干细胞、软骨细胞与成骨细胞等靶细胞进行分化，观察分化后各组靶细胞表型的异同，靶细胞相关RNA和蛋白的表达量的差异，发现NC-iPS细胞系相较于CCF-iPS细胞系，所分化出的神经干细胞形态更接近阳性对照细胞，各项神经干标志物表达水平更高，有功能的神经干细胞数目更多，细胞更成熟，功能更好；所分化出的软骨细胞形态更接近成熟软骨细胞，各项软骨标志物表达水平更高，阿利新蓝和番红O着色面积更大，颜色更深，软骨细胞更多更成熟；所分化出的成骨细胞形态更接近成熟成骨细胞，诱导成骨进程更快，形成的钙结节更多，茜素红染色面积更大，颜色更深，各项成骨标志物表达水平更高。表明CCF的发病可能与病人干细胞向神经干细胞、软骨细胞和成骨细胞分化异常有关。为了明确引发CCF 致病的细胞机制，我们猜测分化异常可能与iPSC分化过程中自身的衰老相关，做了细胞衰老相关检测，发现在诱导过程中CCF-hi PSCs比NC-hiPSCs更容易出现衰老表型，用白藜芦醇修复其衰老表型，发现细胞衰老减少，细胞内活性氧含量下降，细胞增殖能力增强。在临床隐性遗传/散发的先天性马蹄内翻足患者中筛查复合型杂合FRG1 基因突变的情况，也发现有少量患者携带该突变，更加证明FRG1基因对CCF的发生具有影响。本课题通过捕获缺陷细胞并探求其细胞功能障碍，有助于增加对CCF病理的理解，对CCF 病因学的理解具有理论意义。

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