PLP依赖的II-氨基酸脱羧酶家族祖先基因序列重构及其趋异进化机制研究

In this study,molecular biology, bioinformatics and computational biology methods are applied to ancestral genetic sequence resurrection and divergent evolution analysis of group II amino acid decarboxylase family. The multiple amino acid sequences of the family are aligned, and the molecular phylogenetic tree is established. The ancestral amino acid sequences of specific nodes in the evolutionary tree are resurrected by molecular evolution algorithm. The corresponding gene sequences are synthesized according to the calculated ancestral protein amino acid sequences, and ancestral protein activity are characterized by experiments. Based on the data of enzymatic properties characterization, structure and bioinformatics (molecular docking and molecular dynamics simulation) data, mutation position, catalytic promiscuity and stability of the enzymes are compared in different node positions. The interactions among amino acid sites and enzyme structure, enzyme catalytic activity/promiscuity are analyzed. The glutamate decarboxylase mutants with high enzyme activity and thermal stability are obtained using the generalist ancestors as parent protein, and the possible molecular evolution path from the ancestor to specific glutamate decarboxylase is characterized. This study not only provides theoretical guidance and platform technology to resurrect the stem-cell-like ancestral enzyme in order to understand the enzyme divergent evolution process and mechanism, but also provide new methods and new function for tailoring the new specialist enzyme for the target substrate or specific activity.

本研究拟以II-氨基酸脱羧酶家族为研究对象，运用分子生物学、生物信息学和计算生物学的方法，对该酶家族进行氨基酸多序列比对、建立分子系统发育树以及重建进化树中特定节点的祖先序列，依据得到的酶蛋白序列合成相应的基因并通过实验鉴定活性。根据酶学性质表征、结构数据、分子对接和分子动力学模拟数据，比较不同节点祖先酶的突变位置、催化多功能性和稳定性之间的差异，分析氨基酸位点与酶结构、酶催化活性/催化多功能性之间的内在联系。利用"通才"的祖先酶为亲本酶，通过定向进化等获得高酶活力、热稳定性的谷氨酸脱羧酶突变体，并确定由特定节点的祖先酶成为专一性谷氨酸脱羧酶的可能分子进化途径。此研究不仅为具有"stem-cell-like"的祖先酶构建提供理论指导和平台技术，从而为理解酶趋异进化的过程和机制提供最直接的科学证据，而且为针对目标底物或活性定制"专才"的新酶提供新的改造方法和新的性能。

II-氨基酸脱羧酶家族主要包括谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase, GAD）、组氨酸脱羧酶以及芳香族氨基酸脱羧酶，其催化氨基酸脱羧生成的胺类具有重要的生理和药理价值。采用悬滴蒸汽扩散法获得了高质量的Lactobacillus brevis GAD1407晶体，利用X-ray衍射以及采用分子置换法，首次获得了乳酸菌GAD的晶体三维结构（PDB ID：5GP4）。辅酶PLP的醛基与Lys279的Ɛ-氨基之间形成共价希夫碱结构，残基Ser126、Ser127、Cys168、Ile211、Ser276、His278和 Ser321对于PLP定位于活性中心以及发挥其催化功能起着至关重要的作用，位于底物活性口袋上方的柔性loop区域 (Tyr308-Glu312)参与II-氨基酸脱羧酶催化反应，保守残基Tyr308在脱羧反应中起着至关重要的作用。建立了基于分子进化与系统发育分析的家族一致性突变体预测的生物信息学在线工具Consensus Finder，通过该工具筛选得到的突变体H181R的催化效率（kcat/Km）是野生酶的1.24倍，突变体T383K和A163S在50 ℃的半衰期分别为野生酶的1.74和1.45倍。以II氨基酸脱羧酶高度保守的氨基酸序列（motif）为H(I/V)DAAX(G/A)G为探针，获得古细菌Thermococcus kodakarensis中GAD祖先酶的氨基酸序列。选择来自T. kodakarensis GAD中脯氨酸所对应的L. brevis GAD氨基酸位点作为突变位点，最终在Lb. brevis中筛选得到热稳定性提高的突变酶G364P。通过对Lb. brevis GAD1407底物结合口袋的丙氨酸扫描以及定点饱和突变，T215A的kcat/Km是野生酶的1.58倍。根据Lb. brevis GAD1407 三维结构的拉氏图，突变酶K413A 在50 ℃的半衰期为105 min，是野生酶的2.1 倍；突变酶K413I酶活力约为野生型的1.6 倍。利用荧光光谱法研究盐酸胍和尿素作为变性剂诱导GAD的去折叠过程，野生型酶GAD和突变酶K413A 的去折叠过程都符合“三态模型”。 通过筛选并理性改造来源于植物乳杆菌的GAD（LpGadB），获得了C-末端截短的但具有相对更宽泛催化pH范围的LpGadB突变体LpGAD∆11。

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