n-3多不饱和脂肪酸对高脂饮食小鼠精子tsRNAs表达和修饰的影响及作用机制研究

Overweight and obesity not only increase the risk of many health problems, including metabolic disorders, type 2 diabetes, and heart disease et al., but also may lead to long-term health problems for the offspring. Nevertheless the associated mechanisms remain elusive on how obesity impacted the health of offspring. In the previous research, we have identified a class of highly enriched and conserved new small RNA (tsRNAs, tRNA-derived small RNAs) in mature sperm. In high-fat diet (HFD) induced obese mice, the expression profiles and modifications of these sperm tsRNAs were changed significantly. Injection of sperm tsRNA fragments from HFD males into normal zygotes generated metabolic disorders in the F1 offspring, demonstrating that sperm tsRNAs represent a paternal epigenetic factor that may mediate intergenerational inheritance of obesity-related diseases (science, 2016). But the mechanisms that how diet affected the expression and modification of sperm tsRNAs remain unclear. In this present project, we will supplement n-3 polyunsaturated fatty acids to mice that fed a high-fat diet, then systematically analyze the effects of diet on metabolism, the expression and modification of sperm tsRNAs, and the metabolism of offspring. Separation spermatogenic cells of different periods and epididymal adipose tissue for small RNA-seq and transcriptome sequencing. We will therefore explore the mechanisms that how diet affected the expression and modification of sperm tsRNAs, and validate the results with fat-1 transgenic mice. We will expect to determine the mechanisms that how the diet impacted the expression and modification of sperm tsRNAs.

肥胖不但会引起自身代谢紊乱以及2型糖尿病等下游相关疾病，而且对子代健康产生深远的不良影响。但目前对肥胖影响子代健康的作用机制尚缺乏清晰的了解。申请人在前期研究工作中发现，成熟精子中存在一类高度富集且保守的新型小RNA（tsRNAs），在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中，该类精子tsRNAs的表达谱和修饰谱都发生了显著性变化，且这类变化了的精子tsRNAs可以将父代的获得性代谢紊乱遗传给子代，直接导致子代代谢紊乱（science，2016）。该发现为探索肥胖影响子代健康的作用机制提供了全新的视角，本研究将通过对高脂饮食小鼠补饲n-3多不饱和脂肪酸的建模方式，在前期原创性工作的基础上，系统分析饮食结构改变对代谢、精子tsRNAs以及子代的影响，并辅以各级生精细胞及附睾脂肪组织转录水平的生物信息学分析和fat-1转基因小鼠验证，进一步探索饮食结构通过什么作用机制影响精子tsRNAs的表达和修饰。

肥胖不但会引起自身代谢紊乱以及2型糖尿病等下游相关疾病，而且对子代健康产生深远的不良影响。但目前对肥胖影响子代健康的作用机制尚缺乏清晰的了解。而我们在前期研究中发现高脂饮食诱导的肥胖小鼠精子中tsRNA的表达谱和修饰谱都发生了明显的变化，且这种变化了的tsRNA可以将父代的获得性代谢紊乱传递给子代。但高脂饮食如何影响了精子tsRNA的变化，变化了的精子tsRNA如何诱发了子代的代谢紊乱都是悬而未决的问题，基于该背景我们设计了现有实验。在整个试验过程中我们设计并建立了4组小鼠模型（WT组（c57雄鼠饲喂维持饲料）、HFD组（c57雄鼠饲喂高脂饲料）、FO组（c57雄鼠饲喂高脂饲料同时补饲鱼油）、FH组（fat1转基因c57雄鼠饲喂高脂饲料）），通过对生长曲线和代谢指标的系统分析发现补饲鱼油和fat1基因的敲入都可以有效的缓解高脂饮食诱发的代谢紊乱状态，但是都不能完全消除高脂饮食导致的代谢不良影响。通过对各模型组不同类型生精细胞的转录组和小RNA深度测序分析，发现高脂饮食主要影响了代谢通路中脂代谢、核苷酸代谢和氨基酸代谢相关的通路。在前期研究中发现高脂饮食主要影响了tsRNA中m5C和m2G的修饰，在该项目中我们重点分析了生精细胞中高表达（FPKM>5）tRNA甲基化转移酶的表达情况，发现在不同饮食干预情况下生精细胞中m2G甲基化转移酶的表达谱发生了明显的变化，但是并没有发现m5C甲基化转移酶。而我们在究工作中发现Dnmt2缺失可以阻止高脂饮食导致的精子中tsRNA片段中m5C修饰的上升，并能有效阻止高脂饮食导致的父代代谢紊乱向子代的传递。提示tsRNA中出现的多种甲基化修饰位点不是完全在精子发生过程中形成的，具体的发生部位、形式和机制需要后续的进一步探索。通过该项目的探索我们进一步认识了高脂饮食导致精子tsRNA发生变化的可能机制，为进一步设计干预措施提供了参考信息。

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