副猪嗜血杆菌感染产生抵抗素介导渗出性纤维素炎发生机制的研究

Glässer’s disease caused by Haemophilus parasuis（HPS）has become the NO. 1 bacterial killer of swine industry worldwide. The typical characteristic is acute fibrinous exudative inflammation. Through the gene chip technology, researchers identified that the protein up-regulated most in the pig spleen infected by HPS was a Peptide Hormone, Resistin. Our study showed that virulent strains of HPS could significantly up-regulated the expression of Resistin in porcine alveolar macrophages, while Streptococcus suis strains which also cause acute inflammation (but not fibrinous exudatiion) and HPS avirulent strain could not. This suggests that up-regulation of Resistin may be a pathogenic mechanism specific to HPS. Interestingly, by TEER measurement technique it was found that the porcine alveolar macrophages by knockout of Resistin gene, significantly suppressed the increasing permeability of co-cultured endothelial cells infected by HPS. Therefore, this project intends to reveal the mechanism, which of HPS infection leads to produce Resistin causing acute inflammatory response and fibrinous exudative inflammation. How monocytes/macrophages produce Resistin, and how activation of vascular endothelial cell inflammatory signaling pathway causes increasing vascular permeability, providing the basis for the design of safe and effective vaccines and drugs.

副猪嗜血杆菌（HPS）已经成为猪场细菌性疾病的“头号杀手”，给世界养猪业带来巨大的经济损失，其感染最显著的特点是引起猪非常严重的急性渗出性纤维素炎。早期研究通过基因芯片筛选到HPS感染后猪脾脏中表达量上调最高倍数的是肽类激素抵抗素。申请者前期研究发现，HPS强毒株感染猪肺泡巨噬细胞显著上调表达抵抗素，而同样引起急性炎症（但非渗出性炎症）的猪链球菌强毒株或HPS弱毒株感染无法上调表达抵抗素，这暗示了HPS上调表达抵抗素可能是该菌特有的一种致病机制；更有意义的是，HPS感染抵抗素基因敲除的猪肺泡巨噬细胞后跨内皮电阻值显著增高，提示抵抗素导致内皮细胞通透性增高。鉴于此，本项目拟揭示HPS刺激产生抵抗素的分子细节及其在增加血管通透性中的作用，即感染单核/巨噬细胞产生抵抗素的发生机制及其激活内皮细胞炎症信号通路的相关研究，为进一步设计安全高效的HPS疫苗和药物提供科学依据。

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS）给全球生猪养殖业带来重大的经济损失。HPS感染引起严重的全身性的急性渗出性纤维素炎。然而目前关于HPS引起渗出性纤维素炎的具体分子机制研究仍十分欠缺。本研究发现HPS可以诱导猪肺泡巨噬细胞3D4/21表达和分泌抵抗素（Resistin），且Resistin的表达和分泌受到转录因子Ets2的调控。进一步检测发现，HPS感染3D4/21细胞后激活p38 MAPK通路，该通路通过调控Ets2基因的表达，介导Resistin的表达和分泌。跨内皮电阻测定实验发现，3D4/21细胞缺失Resistin后，明显抑制HPS引起的体外共培养体系中原代猪血管内皮细胞（Porcine aortic endothelial cell，PAEC）通透性的升高，表明HPS感染时，3D4/21细胞分泌的Resistin增加了PAEC通透性。进一步研究发现，Resistin通过LKB1/AMPK/mTOR通路抑制PAEC中紧密连接结构蛋白Claudin-5和Occludin的表达，从而增加PAEC通透性。进一步的跨内皮电阻测定发现，HPS强毒株与弱毒株感染3D4/21细胞后，Resistin的表达水平和体外共培养体系中PAEC的通透性均存在显著差异。通过比较强弱毒株间的基因分布差异，筛选出20个显著分布于HPS强毒株中的基因，分别针对这些基因构建单基因缺失株，发现HPS强毒株在缺失细菌外膜脂蛋白基因lppA时，可以显著回复3D4/21细胞中Resistin的表达水平，以及PAEC中Claudin-5和Occludin的表达水平。比较野生型HPS-SH0165与基因缺失突变株ΔlppA及其互补菌株C-lppA发现，HPS的外膜脂蛋白LPPA调控3D4/21细胞中Resistin的表达和分泌。同时，HPS的外膜脂蛋白LPPA通过改变LKB1/AMPK/mTOR通路的活性，调控PAEC中Claudin-5和Occludin的表达以及PAEC的通透性。

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