京尼平苷促胰岛素分泌的葡萄糖依赖性特征及其离子通道调控机制研究

Hypoglycemia is a common adverse reaction in the treatment of type 2 diabetes. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonists are a class of novel glucose-dependent insulin secretagogues, which have low risk leading to hypoglycemia. Thus,the development of new highly effective GLP-1 receptor agonists is the focus of the current antidiabetic research. Recent studies show that geniposide,an iridoid glycoside from the fruit of Gardenia jasminoides Ellis,is a novel agonist for GLP-1 receptor, and exertes hypoglycemic effect.Our data also demonstrate that geniposide glucose-dependently stimulate insulin secretion, indicating its good prospects in the treatment of diabetes.However, the mechanism underlying geniposide's insulinotropic effect remains to be elucidated.It is well established that voltage-dependent potassium (Kv) channels play an important role in glucose-dependent insulinotropic effect. And our preliminary study also showed that geniposide has inhibitory effect on pancreatic beta cell Kv channels. In combination with the findings that have been reported,we hypothesize that the Kv channel as well as cAMP / PKA signaling pathway play an important role in geniposide-mediated insulin secretion. Using patch clamp, calcium imaging, islet perfusion as well as animal in vivo experiments, present project intends to investigat the mechanism underlying geniposide's insulinotropic effect, and to elucidate the key role of Kv channel in the regulation of geniposide-mediaed glucose-dependent insulin secretion. The aim is to obtain a more comprehensive understanding of the hypoglycemic mechanism of geniposide, and provide new insight into the development of geniposide-based new GLP-1 receptor agonists for treatment of type 2 diabetes.

低血糖是2型糖尿病治疗中常见的不良反应。GLP-1受体激动剂是一类具有葡萄糖浓度依赖性的新型胰岛素促泌剂，不易引发低血糖，因而受到广泛重视。研究发现传统中药栀子的主要活性成分京尼平苷是一种新型GLP-1受体激动剂，具有较好的降糖作用。我们的研究也表明京尼平苷具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌作用，显示了其在糖尿病治疗方面的良好前景，然而其作用机制仍待阐明。现已明确Kv通道在葡萄糖依赖性促胰岛素分泌中发挥着重要作用，我们的初步研究也显示京尼平苷具有阻断Kv通道的作用。结合当前对京尼平苷已有的研究结果，我们分析Kv通道以及cAMP/PKA信号通路在介导京尼平苷的促胰岛素分泌中发挥着重要作用。本项目拟采用膜片钳、钙成像、胰岛灌流以及动物在体实验等方法，深入研究京尼平苷的葡萄糖依赖性促胰岛素分泌机制，明确Kv通道在其中的关键作用，为开发以京尼平苷为基础的新型GLP-1类抗糖尿病药物提供理论依据。

中药栀子的主要活性成分--京尼平苷是一种新型GLP-1受体激动剂，有促胰岛素分泌作用，但机制有待阐明。胰岛素分泌实验中，京尼平苷在高糖(8.3mM)时可促进胰岛素分泌，低糖(2.8mM) 时没有此作用，说明京尼平苷可葡萄糖依赖性地促进胰岛素分泌。用GLP-1受体阻断剂（Exendin9-39）、腺苷酸环化酶抑制剂（SQ22536）和蛋白激酶A抑制剂（H89）干预，均减弱京尼平苷的促胰岛素分泌作用；京尼平苷可增加细胞内cAMP含量，且这一过程可被Exendin9-39和SQ22536阻断，说明京尼平苷促胰岛素分泌依赖GLP-1R/cAMP信号通路。膜片钳实验中，用经典的Kv通道阻断剂TEA干预，可促进胰岛素分泌。京尼平苷可浓度依赖性地抑制电压依赖性钾（Kv）通道，延长动作电位时程，促进Ca2+内流，提示京尼平苷可通过抑制Kv通道促进胰岛素分泌。用Exendin9-39、H89、KT5720、TEA干预，京尼平苷对Kv通道的抑制作用被减弱，说明京尼平苷通过GLP-1R/cAMP信号通路抑制Kv通道而促进胰岛素分泌。细胞增殖与凋亡实验中，京尼平苷同GLP-1一样，可促进INS-1细胞的增殖，抑制高糖高脂（30mM葡萄糖+棕榈酸）和Thapsigargin诱导的细胞凋亡，并能减轻二者对INS-1细胞的毒性作用。用Exendin9-39干预，京尼平苷促进增殖抑制凋亡的作用减弱，提示京尼平苷通过GLP-1R发挥促进增殖及抑制凋亡的作用。用京尼平苷干预INS-1细胞及大鼠胰岛，发现京尼平苷能促进INS-1细胞及大鼠胰岛的胰岛素分泌，并能逆转高糖高脂对胰岛素分泌的毒性作用。小鼠在体实验中，禁食后行腹腔注射糖耐量实验（IPGTT），发现京尼平苷可促进C57小鼠的胰岛素分泌，降低血糖水平。总之，我们的研究表明，京尼平苷可通过GLP-1R/cAMP途径，抑制Kv通道，葡萄糖依赖性地促进原代大鼠胰岛的胰岛素分泌；京尼平苷可通过GLP-1R，促进INS-1细胞分泌及增殖，抑制凋亡；京尼平苷可通过促进C57小鼠的胰岛素分泌而降低血糖。本项目的研究结果为新型GLP-1R激动剂——京尼平苷的开发应用提供了一定的理论基础。

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