维药阿里红多糖免疫调节靶细胞及NF-kB信号途径研究

Polysaccharides are a kind of important immunomodulators, its receptor or binding site research are the hot and difficulty in life science. Fomes officinalis has the characteristics of the Ughur herbal resource in Xinjiang, previous study found that Fomes officinalis crude polysaccharide (FOP) has a good immunoregulation effect. Based on our previous study, in order to Fomes officinalis separation of FOP as the research object, using a chemical analysis (GC and GC-MS, MS, NMR, HPLC-ESLD) and other modern polysaccharide analysis methods, to elucidate the chemical structure of polysaccharide of Fomes officinalis. Meanwhile, Firstly, we will study its effects on the proliferation and activation of T、B lymphocytes and macrophages and identify the immune target cells. Secondly, we will screen TLR4, TLR2, CD19 and CR3 as the potential polysaccharide immune receptors on B cells and macrophages membrane with the antibody block method, and then take the gene mutant mice as the research target to verify the binding site by 3H-TdR incorporation test, ELISA and biolayer interferometry. Furthermore, we will study the TLR4/ NF-kB signal pathway of its immunoactivation. Aimed at molecular mechanism to part clarifies the immune FOPS regulation, Provide a new way to study the Uygur Medicine immunological activity of polysaccharide at.

多糖是一类重要的免疫调节剂，其作用位点研究是生命科学领域的热点和难点。阿里红是新疆具有特色的维药资源，前期研究发现阿里红粗多糖（FOP）具有较好的免疫调节作用。本项目拟在前期工作基础上，以阿里红中分离的FOP为研究对象，运用化学分析和仪器分析 (GC和GC-MS，MS，NMR，HPLC-ESLD) 等现代多糖分析方法, 阐明阿里红多糖的化学结构。同时,观察其对T、B淋巴细胞和巨噬细胞活化和增殖功能的影响，确认该活性多糖免疫调节作用的靶细胞；并拟从CD19、TLR4、TLR2和 CR3等已知多糖受体为切入点，应用模式识别受体的单克隆抗体与多糖免疫细胞膜表面已知受体进行竞争性抑制，采用抗体封闭法筛选和鉴别FOP在靶细胞上可能的作用位点，在此基础上，初步探讨FOP对 TLR4/ NF-κB信号通路的调节作用，旨在部分阐明阿里红多糖免疫调节作用的分子机制，为维药多糖的免疫活性研究提供?????。

阿里红(Fomes officinalis Ames)为多孔菌科层孔菌属植物苦白蹄的干燥子实体，为新疆道地药材。阿里红多糖(Fomes officinalis Polysaccharides，FOPS)作为阿里红中重要的生物活性物质之一，具有免疫调节的作用。本项目首先对阿里红多糖采用纤维素阴离子交换柱色谱、琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶等色谱填料进行分离纯化。共获得2种多糖组分（FOPS-a和FOPS-b），运用GC、GC-MS、IR、NMR等现代色谱、光谱技术，结合酸水解、部分酸水解、甲基化、高碘酸氧化和Smith降解等经典化学方法进行多糖组分的结构分析，初步确定了2个多糖组分的结构。其次分析其对巨噬细胞和T、B淋巴细胞和功能的影响，研究表明FOPS和多糖组分FOPS-a与FOPS-b可显著提高巨噬细胞RAW264.7的免疫功能，对B淋巴细胞的增殖和的活化也有显著影响，表明巨噬细胞和B淋巴细胞是FOPS和多糖组分FOPS-a与FOPS-b的免疫调节靶细胞。在此基础上，应用抗体封闭法筛选出TLR4和TLR 2为FOPS和多糖组分FOPS-a与FOPS-b在巨噬细胞上作用位点；TLR4为FOPS和多糖组分FOPS-a与FOPS-b在B淋巴细胞上作用位点。此外，本项目还研究了FOPS、FOPS-a对NF-κB信号途径中2个经典蛋白p- p65和p-IkBα活化程度以及TNF-α、IL-1β、p65、TLR4 mRNA表达量。结果表明，FOPS和FOPS-a能上调p65和IκBα磷酸化水平并能增加TNF-α、IL-1β、p65、TLR4的基因表达水平。表明FOPS和FOPS-a的免疫调节作用机制是通过激活TLR4/NF-κB途径而实现的。表明FOPS和FOPS-a可通过TLR4介导的NF-κB信号通路激活巨噬细胞。另外，分析了FOPS及FOPS-a对RAW264.7细胞中MAPK三个亚基ERK1/2、p38、JNK1 mRNA表达量影响，该结果提示一定浓度的FOPS及FOPS-a可通过上调ERK1/2、p38的mRNA表达，参与ERK1/2、p38MAPK信号通路的激活。FOPS及FOPS-a发挥免疫调节作用的机制可能与MAPK 通路的活化有关。初步阐明了FOPS和FOPS-a激活巨噬细胞的分子机制。通过本项目，已发表论文5篇，培养硕士研究生4名。

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