FZD4介导G蛋白调控肝癌免疫微环境的机制研究

G protein-coupled receptors (GPCRs) are important membrane protein targets for disease treatment and drug discovery. As an important member of the GPCR family, the function of Frizzled 4 (FZD4) in the immune microenvironment of hepatocellular carcinoma (HCC) is unknown. This study aims to elucidate the potential role of FZD4 and its specific regulatory mechanisms in the immune microenvironment of HCC. Previous studies of this subject showed that FZD4 is highly expressed in Th17 cells in the immune microenvironment of HCC, and could promote tumor cell proliferation, angiogenesis and inhibit the apoptosis of HCC cells. The G protein is a heterotrimer bound to the intracellular segment of GPCRs. It is predicted by homology modeling that FZD4 has the potential possibility to bind intracellular G protein α subunit Gα12/13. In this study, we used immunoprecipitation and mass spectrometry to verify the binding sites of FZD4-Gα12/13 predicted by homology modeling. In addition, we used T cell modification, 3D co-culture and adoptive cell transfer model to explore whether FZD4 mediates Gα12/13 to affect Th17 cell differentiation and HCC biological behavior in vitro and in vivo. Taken together, our findings provide a potential biological target for the diagnosis and treatment of HCC.

G蛋白偶联受体（GPCR）是疾病治疗与药物研发的重要膜蛋白靶点。作为GPCR家族的重要成员，卷曲蛋白4（FZD4）在肝癌免疫微环境中的功能未知。本研究旨在阐明FZD4在肝癌免疫微环境中的潜在作用及具体调控机制。本课题前期研究显示：FZD4在肝癌免疫微环境Th17细胞中高表达，且可促进肝癌细胞增殖，血管生成并抑制肝癌细胞凋亡。G蛋白是与GPCR胞内段绑定的异三聚体，通过结构生物学同源建模法预测可知FZD4与胞内G蛋白α亚基Gα12/13具有结合潜能，本研究拟利用免疫共沉淀，蛋白质谱实验对同源建模预测所得的FZD4-Gα12/13结合位点进行验证。并在体外与体内通过T细胞修饰、3D共培养、过继细胞输注模型探究FZD4是否介导Gα12/13影响Th17细胞分化与肝癌生物学行为，以期为肝癌的诊断与治疗提供潜在的生物靶标。

在肝细胞癌（HCC）的发展过程中，肿瘤微环境（TME）对肿瘤细胞有巨大的影响。肝癌的发生、上皮-间质转化（EMT）、肝脏纤维化和细胞侵袭都可能受到TME的调节。癌细胞、免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞和细胞因子是TME的主要组成部分。在HCC的发展中，肿瘤浸润效应细胞、其他细胞和非细胞成分之间的关系很重要。然而，其机制仍不清楚。作为GPCR家族的一员，FZD4可以通过结合细胞外配体而激活，然后解除细胞内段的G蛋白结合，引发信号级联传递的经典信号途径。我们的研究表明，FZD4在肿瘤浸润的淋巴细胞中上调，这在肿瘤微环境中很重要。FZD4可以与Gα12和Gα13结合。然后，利用PLA试验来检查蛋白质的相互作用，结果显示wnt5a可以降低FZD4和Gα12/13之间的结合能力。然而，确切的相互作用位点应在未来进行研究。越来越多的研究认为，Hippo信号通路可以诱导肝脏生长和肿瘤发生。激活型YAP的过量表达或上游激酶的缺失可以诱发肝脏肿瘤的发生和肝脏肿大。在我们的研究中，FZD4可以减少LATS1的磷酸化和YAP的磷酸化，而Gα12/13的敲除则逆转了这种效果。我们检测了YAP的核转位。结果显示，过量表达的FZD4可以诱导YAP的核易位，而Gα12/13的敲除可以减少YAP的易位。我们的研究表明FZD4在HCC肿瘤组织和免疫微环境中的Th17细胞中高度表达。从机制上讲，FZD4可以与细胞内G蛋白α亚基Gα12/13结合，使Hippo通路激酶LATS1去磷酸化，诱导YAP核易位，增强肿瘤细胞增殖和血管生成。

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