基于群体感应luxS/AI-2系统的柠檬色明串珠菌生物膜形成机制探索

The formation of biofilm gives lactic acid bacteria the very strong adaptability, which is conducive to achieving their physiologic function and industrial utilization. The subject is aim to study the quorum sensing (QS) regulation mechanisms of the biofilm formation of Leuconostoc citreum 37. In the preliminary work, the influence factors of biofilm formation and the genes related to QS system has been detected. In this project, firstly, in order to explore whether the biofilm formation of the tested stain is regulated through AI-2/LuxS QS system, a bioluminescent bacterial reporter strain called Vibrio harveyi was employed to detect the QS signal autoinducer-2 (AI-2), in the condition of adding biofilm forming accelerant and inhibitor. Meanwhile, the semi-quantitative PCR method was used to study the expression of luxS gene (The key gene for synthesizing AI-2) at different conditions. Then, the insertional inactivation mutant of luxS gene was constructed and its biofilm formation will be discussed to prove the relationship between AI-2 and LuxS. Finally, Transcriptome Sequencing, Co-Immunoprecipitation and Mass Spectrometry analysis will be done to obtain the differential expressed genes of wild type strain and mutant strain and interactional proteins. After confirmatory experiment, we will put forward the putative regulatory pathway. Thus, the study can provide a theoretical direction for regulation mechanisms of biofilm formation of LAB, and the basic theory for better utilization of LAB by biofilm technology.

乳酸菌生物膜可赋予产生菌很强的适应性，有利于乳酸菌生理功能的发挥和在工业生产中的利用。但是乳酸菌形成生物膜的调控机制还不完全清楚。本课题以可形成生物膜的柠檬色明串珠菌37为实验菌株，在前期试验确定了生物膜形成因素及存在群体感应系统luxS基因的基础上，添加生物膜形成促进剂和抑制剂检测受试菌群体感应信号分子AI-2，并运用半定量PCR法检测在形成生物膜不同条件下luxS基因的表达量，进一步确认受试菌形成生物膜与luxS/AI-2系统有关。之后，通过构建luxS基因缺失突变体，研究突变株的生物膜合成情况；通过突变株和野生株的转录组测序分析差异表达基因；通过免疫共沉淀和质谱分析获得与luxR蛋白相互作用的蛋白质种类，最后对关键基因和蛋白进行验证试验。以期从分子水平证实生物膜合成受群体感应luxS/AI-2系统调控，并提出假设性调控通路。从而，为乳酸菌生物膜调控和利用提供理论基础。

生物膜可保护细菌使其免受宿主免疫系统和抗生素的攻击，是许多病原菌造成难治性感染的重要原因之一。目前致病菌生物膜报道较多，对益生菌生物膜研究还相对较少。因此，食品工业环境或益生菌发酵过程中形成生物膜的情况有必要进行深入探讨。本项目以一株来源于内蒙古传统奶酪来源的可形成生物膜的L. citreum 37为材料，通过全基因组测序，获得调控群体感应与生物膜的基因27个，得到参与群体感应和生物膜形成的通路9条，获得了信号分子AI-2合成相关基因5个并构建了1条合成通路；通过浮游态、被膜态菌株进行AI-2检测及其关键基因表达分析，发现被膜态菌株的基因 luxS，pfs，agrC，agrA的mRNA转录水平均高于浮游态；进一步分析luxS/AI-2系统的相关基因后，选取AI-2合成关键基因luxS进行同源过表达，明确该基因在L. citreum 37中参与调控生物被膜及AI-2的形成；分别采用CRISPR-Cas9系统和同源表达系统构建luxS基因敲除载体；采用生物膜抑制剂，通过蛋白差异分析，明确可能参与L. citreum 37生物被膜形成调控的信号通路有群体感应、ABC转运、双组分系统、糖代谢、能量转换及中心法则等共计15个基因；通过检测群体感应关键基因在群体感应抑制剂的作用下的转录表达情况，以及生物膜及信号分子AI-2活性，获得439个差异表达基因，其中下调表达251个，上调188个；通过GO和KEGG富集分析，差异表达基因主要富集于菌体膜结构成分、群体感应和ABC跨膜转运，差异基因中luxS、pfs、holA、infB、mprF等表达量降低。与前述蛋白质组学分析结果趋势一致。最终绘制了luxS调控QS系统及生物膜形成的假设性通路；另外，被膜态的 luxS 过表达菌株在模拟胃肠液中的存活率高于野生型菌株，固定于纳米材料的被膜态菌株可循环发酵脱脂乳至少5次。因此，生物膜技术可提高益生菌发酵剂的生长和逆环境耐受能力，提供持续的发酵力，在食品发酵工业以及发酵剂工业中具有应用前景。本项目为生物膜技术应用于乳酸菌提高其环境适应性以及发酵剂菌种的高密度培养等方面奠定基础，也为揭示乳酸菌形成生物膜的机理研究提供理论依据。

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