STAT-3介导人参皂苷CK诱导肝癌细胞凋亡的内质网应激作用机制的研究

Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT-3) is the main open and close valve of those genes related to the biological behaviors of tumor development, proliferation, metastasis and invasion, STAT-3 induces cancer cells apoptosis through Endoplasmic reticulum stress pathway. Ginsenoside CK producing a genuine effect in vivo is the active entity of protopanaxadiol type ginseng saponins．In our recent study, we found that Ginsenoside CK could inhibit the proliferation of hepatocarcinoma cells, reduce the expression of STAT-3 and STAT3-phosphorylation, induce hepatocellular carcinoma cells apoptosis. Thus, we speculate that STAT-3 may regulate Ginsenoside CK induce apoptosis in hepatocellular carcinoma cells by endoplasmic reticulum stress pathway. In the current study, we propose to use human hepatoma cell lines, establish the transplanted nude mice model and DEN-induced rat liver cancer model. Then, using molecular biology, CRISPR/Cas9, confocal laser microscopy, in vivo bioluminescence imaging and PET-CT to reveal mechanism of Ginsenoside CK regulate endoplasmic reticulum stress by STAT-3 and induce apoptosis in hepatocellular carcinoma cells from molecular, cellular and animal levels. The aim of this study is to provide theoretical and experimental basis for the development of Ginsenoside CK, and a new ideas for the treatment of liver cancer.

信号转导和转录激活因子3（STAT-3）是肿瘤发生、发展、扩散等生物学行为相关基因启闭的“总阀门”，可以通过活化内质网应激诱导肿瘤细胞凋亡。人参皂苷CK是二醇型人参皂苷在体内发挥活性的实体。我们前期研究发现：人参皂苷CK可抑制肝癌细胞增殖、抑制STAT3及p-STAT3的表达，可以诱导肝癌细胞凋亡，因此推测STAT-3可能介导人参皂苷CK通过内质网应激诱导肝癌细胞凋亡。本项目拟通过细胞实验、建立裸鼠移植瘤模型和DEN诱发大鼠大鼠原发性肝癌模型，采用分子生物学、CRISPR/Cas9、激光共聚焦、活体荧光成像和PET-CT等方法，从分子、细胞、动物层面明确STAT-3介导人参皂苷CK诱导肝癌细胞凋亡的内质网应激作用，揭示其作用机制，为人参皂苷CK的开发利用提供理论基础，为治疗肝癌提供新的靶点和思路。

人参皂苷Compound K为二醇型人参皂苷在微生物中的代谢产物及最终活性成分。在恶性肿瘤中高度活化，参与调控细胞的生长，凋亡及多种信号通路的转导。是细胞为了缓解内质网中非正常蛋白积累造成的压力而形成的一种应答方式。当ERS过强或持续时间过长，超出了自身调节能力时，就会引起细胞凋亡。因此，STAT3和ERS相关的凋亡与抗肿瘤机制研究密切相关。细胞水平的实验证实，通过 MTT 法检测人参皂苷CK对不同肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Huh7及正常肝细胞L02增殖的影响；应用平板克隆实验检测人参皂苷CK处理肝癌细胞后的集落形成； 利用Hoechst染色及流式细胞术检测人参皂苷CK对HepG2和SMMC-7721细胞凋亡的影响；利用免疫细胞化学及免疫荧光技术检测p-STAT3、STAT3的蛋白表达及定位；采用EMSA实验检测人参皂苷CK对人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中STAT3与其靶DNA的结合活性；采用Western Blot 检测肝癌细胞中凋亡相关蛋白、p-STAT3、STAT3及ERS相关蛋白的表达情况；此外，应用CRISPR/Cas9技术敲除STAT3基因及STAT3过表达质粒转染细胞，Western Blot法验证HepG2及SMMC-7721中STAT3的敲除和过表达效果以及进一步验证人参皂苷CK通过STAT3对ERS及细胞凋亡的调控作用。裸鼠移植瘤实验发现人参皂苷CK能够抑制裸鼠移植瘤的肿瘤重量和肿瘤体积，同时裸鼠的体重在5，10mg/kg剂量组中没有显著差异；HE及TUNEL染色表明，人参皂苷CK作用后，移植瘤中细胞坏死及凋亡数增多；免疫组织化学及Western Blot结果显示，ERS相关蛋白GRP78，CHOP，Cleaved caspase 4蛋白表达在人参皂苷CK作用后增多，p-STAT3蛋白的表达减少。通过间断给药二乙基亚硝胺模拟人体肝癌发生、发展过程，建立大鼠肝癌模型发现，肝癌组织中p-STAT3的活化表达显著高于正常肝组织，TTF1-NP给药后发现大鼠肝脏肿瘤区域减小，大鼠肝脏的病理学变化有所缓解，p-STAT3蛋白的表达下调，内质网应激相关蛋白表达明显增加。本研究为肝癌的治疗提供新的干预靶点，为人参皂苷CK的开发提供了理论和实验基础。

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