膜型基质金属蛋白酶靶向多肽探针在肿瘤影像中的研究

The tumor imaging toward matrix metalloproteinases (MMPs) has become a hot topic in the field of molecular imaging. Most of these studies use MMPs substrate for tumor imaging based on the activity of MMPs catalyzed protein hydrolysis, and the effects of imaging is usually significantly influenced by the specificity of substrate. Thus, the discovery of the membrane type- (MT-) MMP targeting ligand and ligand-mediated molecular imaging has important practical and research value. A fluoresce-labelled MT1-MMP binding target peptide was used as probe to carry out in vivo non-invasive imaging of MT1-MMP expressed tumor, which successfully realized the specific tumor targeting imaging of a single MMP. However, the tumor imaging toward MT2-MMP and MT3-MMP has never been reported. In this project, we use phage display peptide library to screen the MT2-and MT3-MMP affinity peptides; use bioinformatic methods and rational design to optimize the affinity and specificity of the affinity peptide; use solid phase binding assays, Atomic Force Microscopy (AFM), Microcal Isothermal Titration Calorimetry (ITC) and other methods to study the binding force, binding sites, the binding specificity and other properties of these peptides with MMPs. Study molecular imaging with fluorescently labeled affinity peptides at the level of cells and animals.The ultimate of the study is to apply new MMPs targeting peptide as support in clinical diagnosis of tumor and anti-cancer drug.

针对基质金属蛋白酶（MMPs）的肿瘤成像是肿瘤成像领域的研究热点。这些研究大多根据MMPs对蛋白的水解活性，利用MMPs底物对肿瘤进行成像，其成像效果受底物特异性影响较大, 因此开发膜型MMPs靶向配体及其介导的分子成像具有重要科研和应用价值。我们前期以膜I型MMP特异性亲和多肽为载体,成功地对表达膜I型MMP的肿瘤进行了非损伤性体内成像,实现了靶向单一MMP的特异性肿瘤成像。目前，靶向膜II、膜III型MMPs的肿瘤成像尚无报导。本项目拟通过噬菌体展示肽库筛选获得膜II、膜III型MMPs的亲和多肽；采用生物信息学的方法优化其亲和力和特异性；并用固相结合实验、AFM、ITC等方法研究这些多肽和不同MMPs作用的结合位点、结合力、结合常数及结合特异性等性质；进而以这些荧光标记多肽为载体在细胞和动物水平进行分子成像。研究最终目的是将新的MMPs靶向多肽应用于肿瘤的临床诊断或抗癌药物的载体。

MMPs是一类高度同源的肽链内切酶，能够降解多种细胞外基质和细胞因子。MMPs家族中的跨膜型MMPs在肿瘤发生、转移、浸润和血管新生中起重要作用。发现可以特异性靶向这些蛋白酶的配体，并以此配体为载体对肿瘤进行生物标记、诊断和治疗，在基础研究和临床科学中都具有重要意义。我们曾首次报道了靶向MT1-MMP的特异性亲和多肽在肿瘤中的生物成像。迄今为止，尚未有分别针对MT2、3-MMP 的特异性多肽探针报道。本项目以跨膜型MMPs为研究对象，分别进行了如下三方面的研究：1、分子模拟优化MT1-MMP靶向多肽及应用于体内光学成像的研究；2、MT2-MMP靶向亲和多肽的筛选及在肺癌分子影像中的应用；3、MT3-MMP靶向亲和多肽的筛选及光学成像研究。目前的结果主要包括：.1、成果地采用生物信息学分子模拟的方法、结合蛋白的结构信息，对前期发现的一种MT1-MMP亲和多肽进行序列优化，提高了其对MT1-MMP亲和力和选择性。采用原子力显微镜和等温滴定量热法对新的MT1-MMP亲和多肽进行了性质表征。在细胞水平成像，结果表明突变优化多肽FITC-MT1-AF7p-H4R荧光标记多肽靶向MT1-MMP的能力较其母肽显著提高。采用MT1-MMP高表达细胞系接种荷瘤小鼠膜型，优化多肽的成像效果也较其母肽显著提高。除了在肿瘤中有较好的富集外，其肾脏清除率也优于母肽。.2、通过ONCOMINE数据库检索、综合微阵列数据的meta分析，预测MT2-MMP在肺癌中存在差异性表达，是肺癌诊断治疗中新的生物标记物或靶点。利用噬菌体展示肽库技术淘选得到一系列靶向MT2-MMP的亲和多肽。用原子力显微镜单分子力谱分别检测MT2-MMP与靶向多肽间的相互作用力，同时进行ITC热力学检测，测定了多肽和蛋白的结合力。在肺癌细胞中实现了靶向MT2-MMP的细胞成像。靶向MT2-MMP的动物成像正在进行中。.3、完成了MT3-MMP的亲和多肽筛选和性质表征，在细胞水平在肺癌细胞中实现了靶向MT2-MMP的细胞成像。靶向MT2-MMP的动物成像正在进行中。

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