复发性低血糖对血脑屏障葡萄糖转运蛋白GLUT1的调控及其在低血糖防御机制受损中的作用研究

In diabetic patients receiving insulin therapy, frequent incidence of hypoglycemia impedes the achievement of tight glycemic control and leads to severe hypoglycemia that can be lethal. Recurrent hypoglycemia impairs glucose defense responses by dampening counterregulation and causing hypoglycemia unawareness, thus creating a vicious cycle of hypoglycemia. An increased brain glucose uptake has been proposed as an etiological factor and been verified in many studies. Consistent with these findings, our preliminary results showed that recurrent hypoglycemia increased GLUT1 expression specifically on the luminal surface of blood-brain barrier (BBB) without changing its total levels. However, the associated mechanisms and the role of BBB GLUT1 in glucose defense responses are still unclear. As a result, we plan to purify luminal GLUT1 and apply mass spectrometry to identify mechanisms responsible for its increased luminal translocation. Meanwhile, we aim to inhibit BBB GLUT1 in vivo after recurrent hypoglycemia, then systematically examine the effects on restoring counterregulation and awareness of hypoglycemia, employing biochemical, molecular and behavioral approaches. The expected results will not only strengthen our understanding of impaired glucose defenses in diabetes, but also offer new insights for designing novel, BBB GLUT1-based preventive strategies in the treatment of hypoglycemia in clinical settings.

糖尿病患者胰岛素治疗中低血糖事件的频发阻碍了血糖的控制达标，并可出现严重低血糖危及生命。目前认为复发性低血糖导致的防御机制受损（包括反向调节缺陷和低血糖感知消失）是造成低血糖恶性循环的主要原因，其可能机制之一是复发性低血糖诱导葡萄糖转运入脑增加。与此观点一致，我们前期研究发现复发性低血糖通过增加大鼠脑内皮细胞中葡萄糖转运蛋白GLUT1的质膜转运上调了其在血脑屏障腔面侧的表达，但具体的调控机制及GLUT1在低血糖防御反应中的作用尚不清楚。本项目拟通过纯化腔面侧GLUT1，利用蛋白质谱技术揭示复发性低血糖增加其质膜转运的机制；同时体内靶向抑制血脑屏障GLUT1，在生化、分子和行为水平上系统研究、阐明其在修复反向调节和低血糖感知中的作用。预期研究结果不仅有助于深化对糖尿病低血糖防御机制受损内在机制的认识，也为开发基于血脑屏障GLUT1的低血糖防治策略提供新思路，服务临床实践。

糖尿病胰岛素强化治疗可助患者快速控制血糖，减轻或延缓并发症的发生发展。然而，该强化治疗过程不可避免地导致了低血糖事件的频繁发生，进而弱化了患者低血糖防御能力，产生了复发性低血糖的恶性循环。其中，一个被深入研究的glucose-transport假说认为，血脑屏障葡萄糖转运蛋白GLUT1介导的葡萄糖分子转运入脑增加是导致低血糖防御能力减弱的重要机制之一。本研究组前期结果证实了复发性低血糖后血脑屏障GLUT1质膜转运能力确实得到了提高，然而其内在调控机制及基于GLUT1靶向治疗在修复低血糖防御缺陷中的作用尚不明确。..为此，我们首先提取了高纯度的大脑皮层毛细血管，制备了总膜蛋白进行蛋白质谱分析。复发性低血糖后虽然GLUT1的翻译后磷酸化修饰水平未受影响，但与囊泡运输功能密切相关的多条通路发生了显著的改变，提示可能是介导GLUT1质膜转运异常的潜在机制。其次，为了验证血脑屏障GLUT1在低血糖防御反应中的作用，我们使用高特异性阻滞剂WZB117体内抑制GLUT1的功能，借助低血糖钳夹技术，评估其修复低血糖反向调节的能力。结果表明，抑制GLUT1虽然未影响血浆胰高血糖素的含量，但显著提升了肾上腺素的水平，改善了机体交感神经系统的兴奋性。与之一致，抑制GLUT1显著增强了与低血糖反向调节密切相关的下丘脑VMH、PVN核区神经元活性。最后，为了进一步阐明抑制GLUT1修复反向调节的内在机制，我们探讨了外周代谢器官对反向调节激素敏感性的变化。结果显示，复发性低血糖未影响肝脏或骨骼肌糖原代谢，但增强了肝脏糖异生。脂肪动员未受影响，但机体成脂能力增强，可能与上调的脂肪酸转运蛋白FATP1有关。另外，复发性低血糖通过上调白色脂肪组织GLUT4，加速葡萄糖清除速率，导致机体更容易发生低血糖现象。综上，本研究首次体内验证了GLUT1在低血糖防御反应中的功能。..糖尿病强化治疗导致患者体重增加，影响血糖控制效果，但内在机制尚不清楚。本研究发现的FATP1可能是潜在靶点分子，为后续研究的开展奠定了良好的基础。上述所有结果均为国际首次报道，具有较高创新性。

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