嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1调控细胞凋亡的分子机制研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31760738
项目类别：
地区科学基金项目
资助金额：
38.0万
负责人：
王勇
依托单位：
石河子大学
学科分类：
C1802.兽医病毒学
结题年份：
2021
批准年份：
2017
项目状态：
已结题
起止时间：
2018-01-01 至2021-12-31

项目参与者：
郑炜；马长宾；陆亚冬；陈新凯；丁金花；马亚茹；
关键词：
分子机制家畜基因功能细菌调控

项目摘要

Type Fourth Secretion System(T4SS) from Anaplasma phagocytophilum plays pivotal roles in regulating host cells apoptosis and promoting pathogen intracellular propagation and survives. The recent research demonstrated that effector Ats-1 inhibited mitochondrial-mediating apoptotic pathway, but the specific mechanism remains unclear. In this study, we will analyze and verificate host protein difference expression profile and apoptosis related proteins regulated by Ats-1 through transfection, isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) and bioinformatics; Screening host targets interaction with LGAS1、TIMP1 by yeast two hybride,yeast co-transformation and IP;The relations between the apoptosis related difference proteins and apoptosis pathway would further analyzed through RNA inference, pathogen infection, quantitative real-time PCR, Western Blot flow cytometry and so on. The molecular mechanism and singnal pathway of apoptosis regulated by Ats-1, and LGAS1,TIMP1 interaction with Ats-1 was intensive illuminate. These works will be useful for us find novel therapeutic targets, develop new preventive vaccines and take some clues for HGA control.

嗜吞噬无形体四型分泌系统(T4SS)在调控宿主细胞凋亡和促胞内生存过程中发挥重要作用。已有研究表明T4SS效应蛋白Ats-1抑制线粒体介导细胞凋亡，但具体机制尚未阐明。本项目以效应蛋白Ats-1为切入点，利用转染、iTRAQ和生物信息学等技术，分析受Ats-1调控的宿主蛋白差异表达谱，筛选与细胞凋亡相关蛋白；利用酵母双杂交、酵母共转化和免疫沉淀等筛选验证与LGAS1、TIMP1互作的宿主细胞靶蛋白；基于上述实验结果，进行生物信息分析，寻找受Ats-1调控的细胞凋亡相关关键蛋白，利用RNA干扰、细菌侵染、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印记及流式细胞术等技术，验证并揭示这些细胞凋亡相关关键蛋白与细胞凋亡信号通路关系，分析阐明效应蛋白Ats-1及其互作蛋白LGAS1、TIMP1参与的细胞凋亡信号通路及调控的分子机制。这将为开发新药物治疗靶标、新疫苗及人兽共患无无形体病防控提供科学依据。

结项摘要

嗜吞噬无形体（Anaplasma phagocytophilum，APH）感染引起的无形体病严重影响人类和动物健康。前期研究发现，无形体效应蛋白 Ats-1 易位到宿主细胞后与细胞凋亡有关，但调控细胞凋亡的分子机制不清楚。本项目开展的主要科研内容如下：.1. 利用iTRAQ技术，筛选受Ats-1 调控的细胞凋亡相关蛋白.构建了真核表达载体pcDNA3.1-Ats-1及细胞转染模型，Western blot验证Ats-1在宿主细胞中正确表达；利用iTRAQ 、PRM 和靶向代谢组学分析、验证受Ats-1调控的细胞蛋白主要集中于线粒体中；其中表达上调的5种蛋白（NDUFB3、NDUFB5、NDUFS7、COX6C和SLC25A5）与细胞凋亡相关，同时也与TCA、氧化磷酸化、糖酵解、磷酸戊糖途径密切相关；qRT-PCR、ATP水平检测、CCK-8检测、流式细胞术证实，Ats-1表达增加了ATP的水平，抑制了细胞凋亡。.2. 筛选并验证与Ats-1互作的宿主靶蛋白及功能验证.利用酵母双杂交技术、酵母共转化、免疫共沉淀，最终筛选到一个与Ats-1互作的宿主靶蛋白SDCBP(Syntenin-1)；通过生物信息学分析、Western blot 检测实验表明，Ats-1促进SDCBP(Syntenin-1)表达上调，同时SDCBP(Syntenin-1)与外泌体生物合成及分泌有关；最后通过外泌体提取纯化、透射电镜、纳米粒子跟踪、外泌体标志物分析实验，证实Ats-1促进HEK293T细胞的外泌体分泌。.3. 结论.本项目从蛋白定量和蛋白定性两方面得出的结论是，无形体分泌蛋白Ats-1进入宿主细胞后，参与了宿主线粒体相关细胞凋亡途径，抑制细胞凋亡；同时，Ats-1与SDCBP(Syntenin-1)互作，增加了宿主细胞外泌体的分泌，最终可能有利于病原无形体在宿主细胞内的生存。