抗真菌指导的地衣内生真菌中活性成分的分离及作用机制研究

The incidence of fungal infection has dramatically increased in recent years. The drug-resistance and drug-tolerance produced by fungi makes current situation much worse. However, the antifungal drugs used in clinic are limited, which promotes us to develop new active antifungal agents with low toxicity and novel therapeutical strategies. Lichens produce abundant secondary metabolites with multiple bioactivities due to their comprehensive growing conditions. The application of endophytic fungi derived from lichens for extracting chemicals can not only provide active agents with a variety of structures, but also overcome the bottleneck of limited lichens resources. Based on our previous research, this project will carry out the separation of endophytic fungi from lichens, extract the fermentation of endophytic fungi, separate the active agents from extractions under the guidance of antifungal activity, modify the structural of some chemicals and analyze the relationship between the chemical structure and bioactivity. The compounds with significant antifungal activity will be chosen for the in-depth research, such as elucidating the regulated signaling pathways in fungi, and exploring the direct target that active compounds bind, which provides the materials and theoretical basis for the discovery of lead antifungal compounds. Investigating the relationship between endophyte metabolites and chemical ecology of lichens also reveals the existed symbiosis laws in ecology.

近年来真菌感染呈显著上升之势，真菌耐药和耐受的出现使得临床上治疗真菌感染更加棘手，目前有限的抗真菌药物迫使我们寻找高效、低毒的抗真菌药物以及有效的抗真菌感染治疗策略。地衣因其广泛的生长环境，蕴含着丰富的活性代谢产物，对地衣中的内生真菌进行开发利用不仅可以获得结构多样的活性产物，还可以解决地衣资源有限的瓶颈。本项目将在前期研究的基础上，开展地衣内生真菌的分离、建立内生真菌发酵提取物库，并进行抗真菌活性指导下的活性成分的分离，并对部分活性化合物进行结构修饰以及构效关系分析。对具有显著抗真菌活性的化合物开展深入的抗真菌机制研究，探索其调控真菌的信号通路，并找到其直接作用的靶标，为抗真菌先导化合物的发现提供物质和理论基础。同时探讨内生真菌代谢产物与地衣的化学生态学关系，揭示内生真菌和地衣共生的生态学规律。

本课题建立了150种地衣内生真菌发酵产物库，通过逆转耐药筛选发现地衣内生真菌Phialocephala fortinii发酵产物具有显著的逆转真菌耐药活性，在活性指导下进行化学成分分离得到15个醌类化合物，其中10个化合物本身无细胞毒及抗真菌活性，却能够通过调控多药耐药外排泵MDR1的表达实现耐药逆转；从Tolypocladium cylindrosporum中分离得到吡啶类化合物pyridoxatin，其表现出与氟康唑相当的抗真菌活性，它能够干扰甾醇合成抑制白色念珠菌的增殖；从Aspergillus versicolor中分离得到二苯醚类化合物diorcinol D，它能够通过促进真菌胞内活性氧的产生及破坏真菌细胞膜双重作用发挥杀菌作用。从 Floricola striata分离到的floricolin C通过破坏白色念珠菌线粒体功能发挥抗真菌作用。从Biatriospora sp.分离到的庚烯酮类化合物biatriosporin D能够抑制外排泵的活性和外排泵基因的表达逆转念珠菌耐药，通过影响cAMP-PKA途径抑制菌丝的形成降低白色念珠菌毒力；从Phaeosphaeria sp.中分离得到芘醌类光敏剂hypocrellin A和calphostin D,并对其光毒活性进行了研究。.完成了近200种苔藓植物中活性小分子的抗真菌活性筛选，倍半萜Chiloscyphenol A通过破坏真菌线粒体功能及破坏真菌细胞膜的完整性杀灭真菌；ent-iLL通过抑制Erg6的活性进而抑制甾醇的合成实现抗真菌作用；从中药龙葵中分离得到的糖苷生物碱Solasodine-3-O-β-D-glucopyranoside（SG）通过调控Ras1-cAMP-PKA信号途径抑制白色念珠菌菌丝和被膜的形成；SG借助葡萄糖基进行真菌胞内，水解为苷元solasodine，进而破坏真菌细胞器vacuole的功能发挥抗真菌作用。.首次建立了基于绿色荧光标记和碘化丙啶染色的持留菌识别方法，实现了持留菌的快速检测与观察，为研究持留菌的产生机制以及筛选清除持留菌药物奠定了研究基础；揭示了真菌中存在的两种解毒方式，即通过脂泡储运和化学光解发挥光毒剂的解毒作用；首次揭示了真菌中的脂泡储运可作为一种新型耐药机制。.本课题研究为从天然产物中开发抗真菌剂奠定了物质和理论基础。

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