新一代功能型杂交胰岛β细胞系的建立及其应用

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31140059
项目类别：
专项基金项目
资助金额：
10.0万
负责人：
张佳林
依托单位：
中国医科大学
学科分类：
C1003.组织工程学
结题年份：
2012
批准年份：
2011
项目状态：
已结题
起止时间：
2012-01-01 至2012-12-31

项目参与者：
孟一曼；李晓航；王凤山；富大智；康铁利；李乐；赵宁；
关键词：
电融合永生化杂交胰岛β细胞系核转移胰岛移植

项目摘要

胰岛移植已成为治疗1型糖尿病理想的方法。供体短缺是制约胰岛移植发展的最主要障碍。在实验室建立可供移植永生化杂交胰岛β细胞系是解决胰岛短缺的主要途径。本课题组利用核转移技术已成功地将可复性表达SV40永生化大鼠成纤维细胞与胰岛β细胞融合并筛选出多株杂交胰岛β细胞系，这些细胞能够适时有效地分泌胰岛素，但细胞增殖活性弱，对血糖变化不够十分敏感，表达Glut-2水平低。为了克服上述杂交胰岛β细胞的缺陷，本课题拟分别用含有SV40和hTERT的重组逆转录病毒感染大鼠肝细胞，研究证实肝细胞高水平表达Glut-2，建立细胞增殖活性更强的永生化肝细胞系。由于SV40和hTERT基因两侧有Cre/LoxP 位点，用Cre-recombinase处理后，SV40和hTERT基因可被切除，将细胞增殖可控性永生化肝细胞与胰岛β细胞进行融合，筛选出对血糖变化更为敏感，增殖活性更强、功能良好的新一代杂交胰岛β细胞系。

结项摘要

胰岛移植一直被认为是治疗1型糖尿病的一种理想手段。供体短缺是制约胰岛移植发展的最主要障碍。在实验室建立可供移植、功能良好、增殖可控的杂交胰岛β细胞系是解决胰岛短缺的一个最为有效的策略和途径。本课题组先前利用Cre/LoxP基因敲除和细胞融合等技术成功地将可复性表达SV40永生化大鼠成纤维细胞与胰岛β细胞融合并筛选出杂交胰岛β细胞系。这些细胞能够分泌胰岛素，但细胞增殖活性弱，对血糖变化不敏感。为了克服上述杂交胰岛β细胞的缺陷，本课题利用Cre/LoxP基因敲除技术分别用含有SV40重组逆转录病毒和TERT慢病毒感染大鼠肝细胞建立细胞增殖可控的永生化肝细胞系。再将上述细胞与胰岛β细胞进行融合，筛选出对血糖变化更为敏感，增殖活性更强、功能良好的新一代杂交胰岛β细胞系。本课题组首先对所用表达SV40T重组逆转录病毒质粒（SSR69）和hTERT慢病毒质粒（pLOX-TERT-iresTK）进行了DNA序列测定，经对比分析，所测结果与基因库相应基因序列一致。熟练掌握消化分离大鼠肝细胞的方法。利用表达SV40T重组逆转录病毒和表达hTERT慢病毒感染分离出大鼠肝细胞，经初步筛选成功地获得了7株永生化肝细胞克隆。用表达Cre-recombinase腺病毒感染上述细胞，SV40 Tag和TERT基因可成功被敲除。此永生化肝细胞克隆细胞增殖具有可逆性。在此基础上，采用电融合技术将可复性的永生化肝细胞与胰岛单细胞融合，并成功地获得了5株具有持续增殖活性杂交β细胞克隆。经初步筛选鉴定选取其中一个杂交β细胞克隆，此细胞内胰岛素含量低于正常胰岛β细胞。目前正继续筛选扩增获得的细胞克隆，进一步行细胞致瘤性、葡萄糖刺激胰岛素分泌和分子生物学特征等方面的评价。本课题组基本按要求如期完成本项国家自然科学基金，并取得一定的阶段性成果。已在国内核心杂志发表论文1篇，待发表1篇。培养博硕士研究生3名。参加国内外学术会议交流2次。本研究对胰岛移植的基础和临床研究具有十分重要理论和实际应用意义，有助于克服和解决目前胰岛移植发展所面临的最大障碍，具有广阔的临床应用前景。同时对其他功能性杂交细胞系的建立提供了新的借鉴和途径。