GRα-Hsp90蛋白复合体介导的分子开关式糖皮质激素全谱检测新方法研究

The existing receptor-based small molecule multi-target detection model has significant methodological defects, which hinder the development of receptor multi-target analysis technology. Using glucocorticoid (GCs) receptor (GRα) as a model and the molecular switching mechanism presented in the signaling pathway of GRα in vivo, this project proposes a new idea for the study of GRα-mediated molecular switching immunoassay of GCs with multi-target. The main contents are as follows: The self-assembly rule, structure and regulation mechanism of molecular components of molecular switches are explored by using means of spectroscopy, electrophoresis, SPR, molecular simulation and so on. The three-dimensional space model and structure-activity relationship of GRα-GCs recognition are studied. The molecular interaction recognition mechanism between molecular switch system and GCs is clarified. The molecular switching multi-target immunoassay system mediated by GRα-Hsp90 is constructed. The full spectrum detection of GCs is expected to be realized. This study is of great significance to break through the bottleneck of multi-target immunoassay technology, and to enhance and expand the level of multi-target biotechnology and its theoretical basis of methodology.

现有基于受体的小分子多靶标检测模式存在显著方法学缺陷，阻碍了受体多靶标分析性技术发展。本项目以糖皮质激素(GCs)为对象，其受体(GRα)为模型，巧用GRα体内信号通路上呈现的分子开关机制，提出GRα介导的分子开关式GCs多靶标免疫检测方法学研究新思路，主要内容为：采用通过谱学、电泳、SPR、分子模拟等手段，探讨分子开关各分子组分的自组装规律、结构及调控机制，研究GRα-GCs识别三维空间模型与构效关系，阐明分子开关系统与GCs的分子互作识别机制，构筑GRα-Hsp90介导的分子开关型多靶标免疫分析方法学体系，期望实现GCs全谱检测。本研究对突破多靶标免疫检测技术瓶颈，提升与拓展多靶标生物分析技术水平与方法学理论基础具有重要意义。

本项目基于HSP90介导的GRα对GCs分子开关识别作用，在重组表达制备GRα和HSP90基础上，通过SPR分子相互作用分析和分子模拟技术，探讨分子识别模型与机制，构建了无需标记的GCs分子开关检测方法模型，主要结果为：（1）完成了GRα和HSP90基因的合成与制备，并重组表达获得了GRα和HSP90。（2）通过非标记亲和力动力学方案，证明了：当缺失HSP90时，GCs与GRα结合活性弱，而当HSP90存在时，亲和识别显著增加，且呈剂量正相关线性关系，说明HSP90体外可为GCs结合打开GRα的LBD区分子开关，与GCs的结合速率常数ka均达到了10^4 L·mol^-1·s^-1，而亲和力常数KD达到了10^-8 mol·L^-1，实现了GCs特异性识别，但HSP90并未随着GCs结合而解离。（3）完成了GCs-GRα-HSP90复合互作识别动态模型构建和机制分析，发现：HSP90通过HM9-10螺旋与GRα的LBD区结合，打开对GC的识别，当GCs结合后，Helix-12构象显著变化，使Hsp90与GRα的作用由HM10转化为HM9结合模式，导致结合力减弱而不是解离，而剂量动力学实验也证实了这个机制，为进一步优化分子开关，实现GCs更灵敏检测提供依据与理论基础。（4）以氟米松、泼尼松和倍他米松为模型化合物，建立了基于HSP90激活的GCs非标记检测模型，GRα与GCs程现良好的剂量依赖性，线性相关系数平方在0.96~0.99之间。（5）发表SCI论文3篇，申请发明专利2件。（6）培养研究生6人，其中博士生2名。

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