Caldicellulosiruptor saccharolyticus纤维二糖差向异构酶CsCE催化乳糖异构化的机制研究及高乳糖异构化活性酶的构建

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基本信息

  • 批准号：
    31771912
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    60.0万
  • 负责人：
    杨瑞金
  • 依托单位：
    江南大学
  • 学科分类：
    C2002.食品生物化学
  • 结题年份：
    2021
  • 批准年份：
    2017
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2018-01-01 至2021-12-31

项目摘要

Caldicellulosiruptor saccharolyticus cellobiose 2-epimerase (CsCE) can not only catalyze the epimerization, it can additionally isomerize the single substrate lactose into lactulose and is the most efficient enzyme ever found for the enzymatic synthesis of lactulose. However, the utilization of CsCE for industrial lactulose bioconversion which exhibits a tremendous advantage has not yet been fully studied. The detailed catalytic mechanism of CsCE is unclear due to the lack of structural data in complex with ligands. Besides, low specificity and weak thermostability as well as the formation of by-product obviously restricted its further industrial amplification. This project plans to investigate and propose the catalytic mechanism by detecting the crystal structures of the CsCE with different substrates, analogs of substrates and intermediate analogs. Based on the determined crystal structures of CsCE-ligands, rational design and computational design were applied to enhance the thermostability、improve the isomerization activity and increase the substrate specificity of CsCE. Food grade expression system with high isomerization activity was constructed in order to facilitate the enzymatic bioconversion of lactulose on an industrial scale by CsCE.
Caldicellulosiruptor saccharolyticus纤维二糖差向异构酶CsCE不仅具有差向异构化活力，还能催化单一底物乳糖直接异构化生成乳果糖，是目前最为高效、最有可能实现工业化的乳果糖制备用酶。目前CsCE差向异构化和结构异构化的催化机理尚不清楚，且存在底物特异性较差、产物不单一、热稳定性有待提高等不足，本项目拟首先通过获取糖-酶晶体并解析结构功能关系，明晰CsCE催化乳糖异构化制备乳果糖的作用机制；在此基础上，结合定点突变解析底物特异性机理；通过理性设计、计算机辅助设计等分子生物学方法对CsCE进行分子定向改造，获取底物特异性专一、异构化活力高且热稳定性强的适合工业化应用的正向突变体酶，并构建具有高乳糖异构化活性的食品级表达载体，推动CsCE酶法制备乳果糖技术的发展。

结项摘要

Caldicellulosiruptor saccharolyticus纤维二糖差向异构酶（CsCE）同时具有差向异构化和结构异构化活性，能够催化单一底物乳糖直接异构化生成乳果糖，是目前最为高效、最有可能实现工业化的乳果糖制备用酶。本项目通过共结晶法首次获得了CsCE与结构异构产物葡萄糖基-β1,4-D-果糖(Glc-Fru)的晶体结构。同时构建了低催化活性的CsCE突变体H247F，通过筛选和解析H247F的复合晶体结构，捕捉CsCE催化的中间产物，明确了CsCE催化的第一步和最后一步为开环和闭环反应，此外，突变实验推测His247可能参与底物的固定和催化过程中底物的正确伸展和引导。随后结合LC-MS和NMR监测，验证了CsCE的差向异构和结构异构催化机制均为cis-enediol机制。随后通过分子动力学模拟和QM/MM计算提出了由His377和His247/Glu250催化的差向异构催化机制及His377和His188共同催化的吡喃糖基和果糖基相互转化的结构异构催化机制。在此基础上，通过理性设计、计算机辅助设计等分子生物学方法对CsCE进行分子改造，构建了基于CsCE的单位点和多位点突变体。获得了结构异构活性显著提高的突变体：CsCE/V177D（1.5倍）、CsCE/I178D（1.7倍）、RmC（2.2倍）、CsCE/Q371E（3.3倍）。其中突变体CsCE/Q371E的底物结合力得到了显著改善，且反应平衡被拉动，乳果糖：依匹乳糖：乳糖的最终比例由60:10:30变为72:8:20。

项目成果

期刊论文数量（10）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
Phenylboronic acid functionalized adsorbents for selective and reversible adsorption of lactulose from syrup mixtures
用于从糖浆混合物中选择性和可逆吸附乳果糖的苯基硼酸功能化吸附剂
  • DOI：
    10.1021/acs.jafc.8b02152
  • 发表时间：
    2018
  • 期刊：
    Journal of Agricultural and Food Chemistry
  • 影响因子：
    6.1
  • 作者：
    Mingming Wang;Fayin Ye;He Wang;Habtamu Admassu;Yinghui Feng;Xiao Hua;Ruijin Yang
  • 通讯作者：
    Ruijin Yang
Highly efficient production and simultaneous purification of lactulose via isomerization of lactose through an innovative sustainable anion-extraction process
通过创新的可持续阴离子提取工艺，通过乳糖异构化高效生产并同时纯化乳果糖
  • DOI：
    10.1021/acssuschemeng.9b07779
  • 发表时间：
    2020
  • 期刊：
    ACS Sustainable Chemistry & Engineering
  • 影响因子：
    8.4
  • 作者：
    Mingming Wang;Fayin Ye;He Wang;Ruijin Yang;Xiao Hua
  • 通讯作者：
    Xiao Hua
Preparation and Characterization of Sugar-Assisted Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs) of Recombinant Cellobiose 2-epimerase from Caldicellulosiruptor saccharolyticus (CsCE)
解糖热纤维素酶 (CsCE) 重组纤维二糖 2-差向异构酶的糖辅助交联酶聚集体 (CLEA) 的制备和表征
  • DOI：
    10.1021/acs.jafc.8b02333
  • 发表时间：
    2018
  • 期刊：
    Journal of Agricultural and Food Chemistry
  • 影响因子：
    6.1
  • 作者：
    Mingming Wang;He Wang;Yinghui Feng;Qinrui Xu;Habtamu Asmassu;Ruijin Yang;Xiao Hua
  • 通讯作者：
    Xiao Hua
Insight into the potential factors influencing the catalytic direction in cellobiose 2-epimerase by crystallization and mutagenesis
通过结晶和诱变深入了解影响纤维二糖 2-差向异构酶催化方向的潜在因素
  • DOI：
    10.1107/s205979832001222x
  • 发表时间：
    2020
  • 期刊：
    Acta Crystallographica Section D-Structural Biology
  • 影响因子：
    2.2
  • 作者：
    Feng Yinghui;Hua Xiao;Shen Qiuyun;Matthews Melissa;Zhang Yuzhu;Fisher Andrew J.;Lyu Xiaomei;Yang Ruijin
  • 通讯作者：
    Yang Ruijin
Insight into the significant roles of the Trp372 and flexible loop in directing the catalytic direction and substrate specificity in AGE superfamily enzymes
深入了解 Trp372 和柔性环在指导 AGE 超家族酶的催化方向和底物特异性方面的重要作用
  • DOI：
    10.1016/j.bej.2020.107662
  • 发表时间：
    2020-09
  • 期刊：
    Biochemical Engineering Journal
  • 影响因子：
    3.9
  • 作者：
    Feng Yinghui;Lyu Xiaomei;Cong Yalong;Hua Xiao;Sun Hong;Wang Lu;Yao Chenxi;Yang Ruijin
  • 通讯作者：
    Yang Ruijin

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    张文斌

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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