基于circRNA-7研究针刺调控脑出血后EGFR/STAT3通路的作用机制

Neurological defects alleviation is a key issue in the treatment of cerebral hemorrhage. The expression of circRNA-7 changes after cerebral hemorrhage, which affects the expression of miRNA-7, thereby activating the EGFR/STAT3 pathway and affecting brain tissue adversely. Based on the findings of the previous researches of National Natural Science of China, acupuncture has a positive effect on the treatment of cerebral hemorrhage, and plays a role in neurological function remodeling. Meanwhile, acupuncture can decrease the expression of STAT3, improve the damage degrees of nerve cell and ultrastructure after cerebral hemorrhage, alleviate the symptoms of neurological function defect, and have a protective effect on neurons. This project intends to replicate the cerebral hemorrhage model rats, introducing the over-expression or knock-down lentivirus, and to observe the changes in brain tissue of the key proteins’ expression of circRNA-7, miRNA-7 in each group and downstream pathway EGFR/STAT3 and whether they are on the same path. Besides, deeply interpretation of the effective targets on alleviating brain tissue damage by acupuncture after cerebral hemorrhage is given, and then verify the hypothesis"acupuncture stimulation -- circRNA-7 regulation -- acting on miRNA-7 -- effects of EGFR/STAT3 pathway -- starting the endogenous restore -- improving the neural defect symptoms after cerebral hemorrhage."

减轻神经功能缺损是治疗脑出血的关键问题，环状RNA-7（circRNA-7）在脑出血后表达出现改变，而影响微小RNA-7（miRNA-7）的表达，从而激活EGFR/STAT3通路，对脑组织产生不良影响。基于前期国自然研究发现：针刺治疗脑出血疗效肯定，并起到神经功能重塑的作用，同时，针刺可以降低STAT3的表达，改善脑出血后神经细胞损伤状态及出血后超微结构的破坏程度，减轻神经功能缺损症状，对神经元有保护作用。本项目拟复制脑出血模型大鼠，引入过表达或敲减作用的慢病毒，观察各组脑组织中circRNA-7、miRNA-7及下游通路EGFR/STAT3的关键蛋白表达的变化以及它们是否在同一条通路上，深入阐释脑出血后针刺减轻脑出血损伤的有效靶点，进而验证“针刺刺激--调控circRNA-7--作用于miRNA-7--影响EGFR/STAT3通路--启动内源性修复--改善脑出血后神经缺损症状”这一假说。

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，严重危害人类的健康。寻找一种有明确疗效的临床治疗方法，降低出血后的神经功能缺损程度，修复受损的神经细胞，保护神经功能，仍是现阶段神经科学研究的重点和难点，而减轻神经功能缺损是治疗脑出血的关键问题。针刺治疗ICH疗效确切，具有安全、有效、不良反应小等优点，可以改善神经功能障碍、降低患者的致残率、提高患者的生存质量等，已被广泛应用于ICH的临床治疗中。因此，本实验采用电镜、免疫组化、Western blot、免疫荧光、Real-time PCR、荧光素酶等多种检测手段以及慢病毒技术，从体内、体外两个水平对针刺的治疗作用及相应的分子机制进行了探究。本实验通过自体血注入尾壳核法建立ICH小鼠模型，用毫针透刺患侧“百会”透“曲鬓”穴和特定的针刺手法进行治疗。结果显示，本针刺方法能够显著降低小鼠出血后的神经功能缺损症状度，抑制或减轻脑损伤程度、保护神经功能。针刺可以降低脑组织中mmu_circ_0001878的表达，从而上调mmu-miRNA-7a-5p的表达，这一过程抑制了EGFR/STAT3通路。进一步的机制研究表明，本针刺方法降低了该通路关键蛋白EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、COX-2的表达，表明针刺可能通过抑制EGFR/STAT3信号通路发挥治疗ICH的作用。之后本研究通过构建mmu_circ_0001878融合载体与mmu-miRNA-7a-5p，mmu-miRNA-7a-5p与EGFR 3'UTR共转染至HEK293细胞中，检测各组荧光素酶活性，验证了mmu_circ_0001878对mmu-miRNA-7a-5p，mmu-miRNA-7a-5p对EGFR/STAT3的靶向调控作用。综上所述，本研究证实了“百会”透“曲鬓”穴的针刺方法能够减轻ICH损伤，进一步揭示了ICH损伤分子机制并为ICH损伤的治疗提供了一种有效的治疗方法，为临床治疗脑出血疾病提供新的实验基础。

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