甘蓝S受体激酶下游未知信号传导元件编码基因的克隆与功能分析

The conclusion that ARC1 was the downstream signaling component of S receptor kinase in self-incompatibility pathway in Brassica, was under question and denied in 2014. This coincides with the preliminary results of two-dimensional electrophoresis of proteins and transcriptomic studies in our research group during recent years. To further understand the mechanism of self-incompatibility response and seek potential candidate proteins involved in downstream signaling components of S receptor kinase in self-incompatibility pathway, the proteomic, yeast two-hybrid system, in vitro expression, Ni ion trapping electrophoresis and genetic transformation approaches would be taken to analyze the differential expression protein and the differential coding gene sequence of transcription in self-incompatibility Brassica stigma. The project will make novel supplements for understanding the molecular mechanism of self-incompatibility in Brassica.

甘蓝自交不亲和性S受体激酶下游信号传导元件是ARC1的结论在2014年受到质疑和否定，这与我们课题组近年来的蛋白质双向电泳分析和转录组学研究的初步结果相吻合。本项目拟在这些初步结果的基础上，进一步利用生物质谱、酵母双杂交和Ni离子捕获剩余电泳等方法组合而成的新颖技术路线，对授粉引起的自交不亲和甘蓝柱头的差异表达蛋白和差异转录序列的编码基因进行克隆、体外表达和遗传转化分析，以期能克隆甘蓝S受体激酶下游未知信号传导元件的编码基因，为芸苔属自交不亲和性的分子研究提供新的内容。

项目针对甘蓝S受体激酶下游元件出现争议的前沿进展，按照申请书的研究内容，在蛋白质组学、转录组学、候选未知基因、目标基因的功能和转基因株系的获得等方面的研究，取得了如下主要结果。.（1）采用双向凝胶电泳技术，对SI甘蓝不亲和与亲和授粉后3-5min、1h和2h的花柱总蛋白质进行分离，得到分辨率和重复性均较好的2-DE图谱。鉴定并统计两两时间点之间的差异表达蛋白质点65个，对这些差异蛋白点，进行了MALDI-TOF-MS质谱鉴定。完成了相关蛋白质组学分析。 .（2）对SI甘蓝自花授粉0 min、15 min、30 min和60 min后柱头RNAs进行分离纯化，送百迈克进行转录组测序，共获得了60.25Gb Clean Data，各样本Clean Data均达到7.31Gb，Q30碱基百分比达到93.06%。鉴定并统计两两时间点之间的差异表达基因11551个。完成了相关转录组学分析。 .（3）综合上述两个组学分析，以相关性和特异性为筛选标准，对至少15种相关候选未知基因进行了克隆、进化分析、染色体定位和细胞学定位分析、原核表达Ni离子捕获电泳分析、超表达分析和遗传转化研究。证明BoSPI、BoSU03、MLPK和PUB3等基因与SRK呈现表达相关性， PUB系列基因、BoSU03和MLPK等基因与SRK呈现互作相关性。将与SRK同时呈现这两种相关性的MLPK和PUB3作为SRK下游候选未知新元件编码基因。 .（4）对于PUB3基因，我们成功获得BoPUB3-GUS转基因株系和BoPUB3-1300GFP超表达株系。表型分析发现过表达株系在莲座叶4至10期皆比野生型的弱小，结籽率下降，在钠、钙处理后，过表达植株系的这些性状更为明显。我们还从全基因组分析了PUB家族成员参与SI、花器发育和抗逆性等诸多功能，为今后深入研究开拓了广阔空间。 .（5）对于MLPK基因，我们在甘蓝中克隆了与SRK互作的新基因MLPKn1及MLPKf2。用 CRISPR-Cas 9 对 BoMLPKn1 拟南芥直系同源基因 AtAPK1b 基因组进行定点敲除，获得突变体植株，在我们获得Brassica材料“Yellow sarson”的MLPKf2遗传转化株系中表现SI性状。. 培养硕士6人和博士生2人，已在重要刊物公开发表学术论文著作成果25项。圆满完成原申请书的任务。

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