用新型化学交联剂结合质谱技术分析蛋白-蛋白相互作用

Chemical Crosslinking coupled with Mass Spectrometry or CXMS is one of the most exciting new techniques in the mass spec field in recent years. CXMS can provide valuable information about protein folding and protein-protein interactions. It can help determine the overall architecture of a large protein complex by identifying direct binding partners within the complex and localizing the binding interface. Protein samples need not be highly purified for CXMS as they must be for crystallography and NMR. In this proposal, we take advantage of our expertise in CXMS technology and strive to improve it further. Specifically, we have designed and synthesized a set of special cross-linkers that would allow enrichment or purification of cross-linked peptides. We will carefully examine these novel cross-linkers using different types of samples and select the best one for maximal sensitivity, efficiency, robustness, and ease of use in CXMS analysis. Armed with the newest and best cross-linker, we will advance the technical front by exploring three types of applications: (1) CXMS analysis of relatively pure, large protein complexes in order to understand the assembly of subunits, (2) CXMS analysis of "dirty" immunoprecipitates in an attempt to identify proteins that directly bind to the bait protein, (3) CXMS analysis of highly complex whole-cell lysates (or cell-lysate fractions after ion-exchange or gel-filtration chromatography) to map the protein-protein interaction network. We plan to demonstrate the power of CXMS in biological research with real-world samples, and we will optimize the workflow for each type of application so that ordinary biology labs can use it without difficulty.

化学交联结合质谱技术（Chemical Crosslinking coupled with Mass Spectrometry,或CXMS）是近几年质谱领域最令人瞩目的新技术之一。通过使用化学交联剂处理蛋白质样品、酶切成肽段、再逐一鉴定每两条以共价键相连的肽段的序列及交联位点，CXMS能够为研究蛋白质结构以及蛋白-蛋白相互作用提供丰富的实验信息，而且具有周期短、对样品的纯度要求低等特点。在本项目中，我们将充分利用实验室自身在CXMS技术方面的优势，从一系列专门为CXMS设计的、可以分离和富集交联肽段的新型化学交联剂中，筛选出一个实用效果最好的分子，用以提高方法的灵敏度，推广CXMS的生物学应用。我们将采用装备了新型交联剂的CXMS方法分析中度或高度纯化的蛋白质复合物、纯度很差的免疫共沉淀样品和高度复杂的全细胞裂解液及其组分。从这些实践中，我们将摸索和建立用CXMS技术解析蛋白质复合物结构。

化学交联结合质谱技术（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry)，简称 CXMS，是近年来蛋白质组学技术的生长点，它利用化学交联剂将蛋白质或蛋白质复合体中空间距离足够接近的两个氨基酸（通常是赖氨酸）通过共价键连接起来，酶切成肽段后用质谱鉴定出交联位点，从而提供低分辨度的结构信息。相比于传统方法， CXMS对样品量和样品纯度要求低，分析迅速、通量高。因此，CXMS在过去几年中得到了广泛应用，常常助力电镜、结构建模等方法，成为解析大型蛋白质复合体三维结构的有力工具。但是，CXMS技术对复杂样品不够有效，主要原因是交联反应产物多样、交联肽段被其它信号淹没而难以鉴定。..在本课题中，我们与合作者共同开发了一系列带有生物素标签、化学切割位点、并可被同位素标记的氨基特异性化学交联剂，称为Leiker。我们甄选出了性能最佳的Leiker，并建立了一套高效的富集策略。与不具备富集功能的交联剂相比，Leiker将交联肽段的鉴定数目提升了至少四倍。我们将该技术应用于大肠杆菌70S核糖体样品中，获取了大量核糖体柔性区域的结构信息，而这些信息是传统的X射线晶体学或冷冻电镜难以获得的。在更复杂的酵母外切体 (exosome) 的免疫共沉淀样品中，我们找到了两个外切体的直接结合蛋白以及15对外切体核心亚基之间的蛋白-蛋白相互作用。在复杂程度更高的大肠杆菌和秀丽隐杆线虫全细胞裂解液中，我们用Leiker分别鉴定到了3130和893对交联肽段对，与之前同类样品的鉴定记录相比，提升了8–22倍。最后，利用Leiker可被氘代标记的特点，我们建立了一套CXMS定量流程，用于寻找蛋白质构象的变化。以一个RNA结合蛋白的简单体系为例，我们通过比较有和没有RNA的蛋白样品找到了3个RNA结合位点。最后，我们比较了对数生长期和静止期的大肠杆菌，鉴定出了静止期特有的一对相互作用蛋白。上述结果表明，Leiker作为一种新型的有富集效果的多功能化学交联剂，是解析大型蛋白质复合体结构、鉴定复杂样品中蛋白相互作用和检测蛋白构象变化的有力工具。..上述成果2016年发表在《eLife》(doi: 10.7554/eLife.12509)。

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