基于纳米抗体的酶触发点击化学-等离子体ELISA检测赭曲霉毒素A生物传感体系的构建研究

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基本信息

  • 批准号：
    31760493
  • 项目类别：
    地区科学基金项目
  • 资助金额：
    38.0万
  • 负责人：
    刘星
  • 依托单位：
    海南大学
  • 学科分类：
    C2008.食品质量与安全检测
  • 结题年份：
    2021
  • 批准年份：
    2017
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2018-01-01 至2021-12-31

项目摘要

Ochratoxin A (OTA) is a common food contaminant, and it can cause multiple biological toxities to human beings and animals. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and colloidal gold immunochromatography (CGI) are commonly used for the routine screening of OTA. ELISA has the advantage of high detection sensitivity, but its operation is relatively complicated and time-consuming. CGI has the advantages of easy operation, fast detection and result analysis by naked eyes, while its detection sensitivity is relatively low. Enzyme-triggered click chemistry-plasmonic ELISA (ECC-pELISA) has the advantages of both methods, and the preparation of detection antibody with higher affinity is a key point to further improve its detection sensitivity. In this proposal, the molecular recognition mechanisms of anti-OTA nanobody (Nb) prepared in our previous work will be studied with homology modeling and molecular docking. Nb with improved affinity will be developed by directed modification and then applied to construct nanobody-alkaline phosphatase (Nb-ALP) fusion protein. The feasibility of Nb-ALP fusion protein’s application to establish an ECC-pELISA biosensing system will be further investigated. This study provides a model basis of directed modification for engineered antibodies, and also a new approach for fast, visual and highly sensitive detection of small molecular compounds.
赭曲霉毒素A（OTA）是一种常见的食品污染物，对人和动物具有多种生物毒性作用。酶联免疫吸附分析（ELISA）和胶体金免疫层析（CGI）是OTA例行筛查中常用的两种方法：ELISA的检测灵敏度高，但操作相对繁琐耗时；CGI具有操作简单、检测快速、裸视判读结果等优点，但检测灵敏度相对偏低。而基于酶触发点击化学的等离子体ELISA（ECC-pELISA）兼具ELISA和CGI的优点，制备高亲和力的检测抗体是实现进一步提高其检测灵敏度的关键。本项目拟在已获得的抗OTA纳米抗体（Nb）的基础上，采用同源建模和分子对接技术探析抗OTA Nb的分子识别机理，并通过定向改造获得具有更高亲和力的Nb，进而制备纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白并探讨其运用于构建ECC-pELISA生物传感体系的可行性。本研究能为其他基因工程抗体的定向分子改造提供模式依据，并为其他小分子化合物的快速、可视化、高灵敏检测提供思路。

结项摘要

赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）是一种常见的食品污染物，对人和动物具有多种生物毒性作用及致癌性。因此，建立快速、灵敏的OTA检测方法对于保障消费者食品安全和生命健康具有重大意义。酶联免疫吸附分析（ELISA）和胶体金免疫层析（CGI）是OTA例行筛查中常用的两种方法。ELISA检测灵敏度高，但操作相对繁琐耗时；CGI具有简单快速、裸视判读结果等优点，但检测灵敏度相对偏低。本项目针对模式小分子OTA在实际检测中遇到的快速、可视化、高灵敏检测的关键问题，以纳米抗体（nanobody, Nb）作为识别探针，开展了基于纳米抗体的酶触发点击化学-等离子体ELISA（enzyme-triggered click chemistry-plasmonic ELISA, ECC-pELISA）生物传感体系的构建研究。第一，利用纳米抗体的单域特征和易于遗传操作的优点，对OTA特异性纳米抗体Nb28进行体外亲和成熟研究。经同源建模、分子对接和丙氨酸扫描确定了Nb28与OTA互作的四个关键氨基酸位点，将上述四个关键氨基酸位点进行两两配对并制备了两个双位点定点饱和突变噬菌体展示文库，经淘选鉴定后获得了亲和力更高的纳米抗体突变子Nb-G53Q&S102D，其IC50为0.29 ng/mL，KD值为52 nM，分别比Nb28低1.4倍和1.36倍。第二，选择Nb28高亲和力的突变子Nb-G53Q&S102D，并利用C4bpα自组装肽制备了Nb-ALP七聚体融合蛋白（Nb-C4bpα-ALP）。以Nb-C4bpα-ALP为识别探针，通过优化Cu2+浓度、抗坏血酸磷酸盐浓度、去磷酸化时间等实验条件，初步构建了基于ALP触发CuAAC检测OTA的ECC-pELISA生物传感体系，其裸眼检测阈值为0.63 ng/mL。综上，本研究首次对免疫库筛选获得的纳米抗体进行体外亲和成熟，结合筛选结果及模拟仿真发现，氨基酸残基的极性、疏水相互作用和侧链空间位阻对于抗体与抗原相互作用至关重要，研究结果对解析纳米抗体结构与功能的关系以及纳米抗体的体外亲和成熟具有一定的参考价值。此外，检测OTA的ECC-pELISA生物传感体系的建立，解决了传统ELISA平台与快速、高灵敏、可视化检测的统一问题，为小分子污染物的可视化、高灵敏快速检测提供了模式依据。

项目成果

期刊论文数量（15）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（2）
鲨源单域抗体的研究进展
  • DOI：
    10.13345/j.cjb.190460
  • 发表时间：
    2020
  • 期刊：
    生物工程学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    刘星;陈奇
  • 通讯作者：
    陈奇
Electrochemiluminescence Immunosensor Based on Nanobody and Au/CaCO(3) Synthesized Using Waste Eggshells for Ultrasensitive Detection of Ochratoxin A.
基于纳米抗体和废蛋壳合成Au/CaCO3的电化学发光免疫传感器超灵敏检测赭曲霉毒素A
  • DOI：
    10.1021/acsomega.1c05213
  • 发表时间：
    2021-11-09
  • 期刊：
    ACS omega
  • 影响因子：
    4.1
  • 作者：
    Li L;Liu X;He S;Cao H;Su B;Huang T;Chen Q;Liu M;Yang DP
  • 通讯作者：
    Yang DP
Nanobody-based fluorescence resonance energy transfer immunoassay for noncompetitive and simultaneous detection of ochratoxin a and ochratoxin B
基于纳米抗体的荧光共振能量转移免疫分析法，用于非竞争性同时检测赭曲霉毒素 a 和赭曲霉毒素 B
  • DOI：
    10.1016/j.envpol.2019.04.135
  • 发表时间：
    2019-08-01
  • 期刊：
    ENVIRONMENTAL POLLUTION
  • 影响因子：
    8.9
  • 作者：
    Tang, Zongwen;Liu, Xing;Xu, Yang
  • 通讯作者：
    Xu, Yang
Development of a horseradish peroxidase-nanobody fusion protein for visual detection of ochratoxin A by dot immunoassay.
开发辣根过氧化物酶-纳米抗体融合蛋白，用于通过斑点免疫分析视觉检测赭曲霉毒素A
  • DOI：
    10.1039/d0ra06576e
  • 发表时间：
    2020-09-10
  • 期刊：
    RSC advances
  • 影响因子：
    3.9
  • 作者：
  • 通讯作者：
Nanobody-alkaline phosphatase fusion-mediated phosphate-triggered fluorescence immunoassay for ochratoxin a detection
纳米抗体-碱性磷酸酶融合介导的磷酸盐触发荧光免疫分析法检测赭曲霉毒素a
  • DOI：
    10.1016/j.saa.2019.117617
  • 发表时间：
    2020-02-05
  • 期刊：
    SPECTROCHIMICA ACTA PART A-MOLECULAR AND BIOMOLECULAR SPECTROSCOPY
  • 影响因子：
    4.4
  • 作者：
    Wang, Xuerou;Wang, Yuanyuan;Liu, Xing
  • 通讯作者：
    Liu, Xing

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其他文献

Rational interpolation operator with finite Lebesgue constant
具有有限勒贝格常数的有理插值算子
  • DOI：
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  • 发表时间：
    2022-01
  • 期刊：
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  • 影响因子：
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    章仁江;刘星
  • 通讯作者：
    刘星
兰坪金顶跑马坪铅锌矿床幕式流体混合成矿作用——矿石组构证据
  • DOI：
    10.16111/j.0258-7106.2017.02.009
  • 发表时间：
    2017
  • 期刊：
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  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    余静;薛传东;杨天南;侯增谦;宋玉财;向坤;梁明娟;王红岩;廖程;唐靓;来瑞娟;杨天云露;杨献珍;刘星
  • 通讯作者：
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Dy-Ni-Mn合金吸波性能的研究
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  • 发表时间：
    2016
  • 期刊：
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  • 影响因子：
    --
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    潘顺康;熊吉磊;刘星;林培豪;成丽春;周怀营
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    周怀营
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  • DOI：
    10.13336/j.1003-6520.hve.20180628015
  • 发表时间：
    2018
  • 期刊：
    高电压技术
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    刘星;汤自安;张凯
  • 通讯作者：
    张凯
Bank equity connections, intellectual property protection and enterprise innovation: A bank ownership perspective
银行股权关系、知识产权保护与企业创新：银行所有权视角
  • DOI：
    10.1016/j.cjar.2016.04.002
  • 发表时间：
    2016
  • 期刊：
    China Journal of Accounting Research
  • 影响因子：
    3.6
  • 作者：
    刘星;蒋水全
  • 通讯作者：
    蒋水全

其他文献

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刘星的其他基金

基于新抗原受体可变域的赭曲霉毒素A竞争物与VHH抗体互作的亲和力调控机制
  • 批准号：
    32102067
  • 批准年份：
    2021
  • 资助金额：
    30 万元
  • 项目类别：
    青年科学基金项目

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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