氯噻啉重链抗体亲和性和特异性关键氨基酸残基作用机理的研究

Immunological detection technology is one of the most important screening methods for pesticide residue, antibody is the core of immunological detection technology, and the quality of the antibody directly decides the sensitivity and specificity of the detection method. Structural characteristic of heavy chain antibody is apt to optimize affinity and specificity of antibody by genetic manipulation, but lack of study on the mechanism of 'hot spot' residues associated with the affinity and specificity of anti-pesticide heavy chain antibody, which limits optimization of heavy chain antibody on genetic level. This project applies vitro evolution and computer-assisted molecular modeling, combines the structure characteristic of heavy chain antibody,and based on previous research work of enzyme-linked immunosorbent assay for imidaclothiz, the study on mechanism of 'hot spot' residues associated with the affinity and specificity of anti-imidaclothiz heavy chain antibody was carried out. For detail, establishing phage display heavy chain antibody library, obtaining anti-imidaclothiz phage display heavy chain antibody by affinity panning, preparation serial heavy chain antibody with variable sensitivity and specificity by vitro evolution, revealing the mechanism of 'hot spot' residues associated with the affinity and specificity of heavy chain antibody by using molecular modeling software, and verification of the mechanism. Through carrying out this project, a theoretical basis will be provided for optimization of anti- imidaclothiz heavy chain antibodies, and the lack of study on the mechanism of 'hot spot' residues associated with the affinity and specificity of anti-pesticide heavy chain antibody will be made up.

免疫检测技术是重要的农药残留筛查手段之一，抗体是免疫检测技术的核心，抗体的质量直接影响检测方法的灵敏度和特异性。重链抗体的结构特点易于进行基因操作优化抗体的亲和性和特异性，但是缺乏对农药小分子重链抗体亲和性和特异性关键氨基酸残基作用机理的研究，限制了基因水平上对重链抗体的优化。本项目利用体外进化和计算机辅助分子模拟技术，结合重链抗体的结构特点，在前期氯噻啉酶联免疫吸附分析的研究工作基础上，开展氯噻啉重链抗体亲和性和特异性关键氨基酸残基作用机理的研究。通过构建噬菌体展示重链抗体库；淘选获得抗氯噻啉噬菌体展示重链抗体；体外进化制备系列具有不同亲和性和特异性的重链抗体；分子模拟揭示重链抗体亲和性和特异性关键氨基酸残基的作用机理并进行验证。项目的开展，预计能够为氯噻啉重链抗的优化提供一定的理论基础，并弥补农药小分子重链抗体亲和性和特异性关键氨基酸残基作用机理研究的缺乏。

将化学合成的氯噻啉半抗原与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）和氨基磁珠偶联制备了免疫原、包被抗原和氨基磁珠抗原结合物。构建了噬菌体展示非免疫重链抗体库，转化率为8.9×108 pfu/µg，扩增后滴度为5.9×1012；构建了四批噬菌体展示免疫抗体库，转化率分别为2.82×109、1.55×109、7.5×108和1.22×109 pfu/µg，扩增后滴度分别为1.55×1013、3.09×1013、3.74×1012和7.3×1012。使用包被抗原和氨基磁珠抗原结合物对非免疫和免疫重链抗体库进行了淘选，获得了5种能够与半抗原特异性结合的重链抗体。通过计算机辅助模拟对5种重链抗体进行了同源模建，与氯噻啉半抗原的对接结果表明重链抗体的活性位点由多个氨基酸残基组成的一个较深的疏水腔，氯噻啉半抗原与重链抗体之间存在T-π、π-π和氢键相互作用。.利用氯噻啉抗体建立了荧光偏振免疫分析方法和基于内滤效应的上转换荧光免疫分析方法。经优化后，各检测方法的IC50（或SC50）值分别为87.94和18.90 ng/mL，与除吡虫啉以外的类似物没有交叉反应。从噬菌体展示多肽库中淘选获得了有机磷类农药、噻虫啉和苯噻菌酯的模拟表位，以及苯噻菌酯的抗免疫复合体。建立了竞争和非竞争噬菌体酶联免疫吸附分析方法，其敏感性比基于化学合成包被抗原建立的ELSIA提高了2至120倍，并且非竞争具有更强的特异性。首次建立了噬菌体免疫环介导等温扩增检测技术，实现了分子扩增技术对小分子化合物的检测。利用计算机辅助技术研究了有机磷农药类特异性抗体与多肽之间的作用机制，结果表明多肽中的Pro8结合在抗体Tyr34、Tyr51、Trp48、Tyr108、Phe109构成的疏水腔中，并与上述残基存在疏水作用。根据作用机制研究的结果，设计并构建了15种突变体，通过噬菌体ELISA的验证，其中3个突变体的敏感性优于母体。.相关研究促进了噬菌体展示技术在农药免疫分析中应用，为农药免疫分析技术的核心试剂的制备提供了新思路，初步探索了噬菌体展示重链抗体和多肽的作用机制和优化途径。研究结果发表了6篇SCI论文，其中第1标注4篇；申请发明专利5项，授权1项。

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